流式細胞術(shù)在細胞生物學、分子遺傳學、微生物學、免疫學、分子生物學以及臨床腫瘤學、臨床血液學等諸多領(lǐng)域都有廣泛應用。本節(jié) 概要介紹它們的技術(shù)途徑及主要原理，大家可以從中看出它們是和細胞化學密切相關(guān)的。
一、FCM應用的技術(shù)途徑
FCM是通過測量細胞的多種參量來獲取信息的。細胞參數(shù)分為結(jié)構(gòu)參量和功能參量兩大類。結(jié)構(gòu)參量主要用于描述細胞的化學組分和形態(tài)特征；功能參量主要是描述細胞整體的理化和生物特性。這些參量有的需要經(jīng)熒光標記方可測定，有的并不需要熒光標記。DNA以及RNA的含量，蛋白總含量、胞內(nèi)pH值和細胞大小等為結(jié)構(gòu)參數(shù)；細胞周期動力學、特殊配體的鑒定、特殊細胞的生物活性等則為功能參數(shù)。
1．DNA和RNA的測量和分析DNA和RNA的含量可以用多種熒光探針標記后測出。對細胞內(nèi)DNA含量的測定可用于細胞生物學方面的研究和臨床腫瘤學的診斷；測量RNA的含量可用于血液中的網(wǎng)織紅細胞的檢測和計數(shù)；DNA和RNA含量的測定可以用于區(qū)別細胞周期中的G0和G1期。常用的熒光探針有吖啶橙（AO，Acridine·orange)、派洛寧Y（PY，Pyronine Y)、HO（Hoechst)系列和色霉素A3（CA3)等。利用HO/CA3雙染色還可分析DNA的堿基組成。還可以結(jié)合Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脫氧尿嘧啶核苷)單克隆抗體免疫熒光來測定細胞內(nèi)DNA合成。
2．蛋白質(zhì)總量測定用FCM可以測定細胞中蛋白的總含量，以檢測一個細胞群體生長和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細胞亞群，如血液中的白細胞的分類。檢測總蛋白的常用熒光探針為異硫氰基熒光素（FITC，F(xiàn)luorescein isothiocyanate)，F(xiàn)ITC以共價鍵方式與蛋白上帶正電的殘基結(jié)合。
3．特殊配體的測定配體是與不同的細胞結(jié)構(gòu)特異結(jié)合很強的各種大分子和小分子，通過對特異性的熒光標記的配體的測定可以獲得不少有關(guān)結(jié)構(gòu)參量和功能參量的信息。例如用標記的外源凝集素可檢測細胞表面糖；用標記抗體可測表面抗原；用標記多聚陽離子可檢測細胞表面電荷；用標記的激素、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和病毒等可檢測細胞受體；用標記的大分子、微生物等可檢測細胞的內(nèi)吞性；用熒光素標記的親和素以及帶有DUTP的生物素衍生物的DNA探針跟靶細胞的DNA雜交能夠檢測原位的特殊基因等。這方面的應用范圍廣、有前途，已經(jīng)成為研究細胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的強有力的新技術(shù)。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、若丹明系列（如四甲基異硫氰基若丹明TRITC、異硫氰基若丹明X-RITc 和美國德州紅等)、藻膽蛋白系列等。由于各種熒光探針具有不同的光譜特性，在使用中要注意正確地使用激光光源和濾片。
4．生物活性的測定就生物流行性來說，主要包括兩方面工作：①細胞本身的死活；②活細胞生物功能發(fā)揮的強弱。前項工作單一，后項工作要復雜得多。FCM用來判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細胞膜進入細胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)；例如下醋酸酯熒光素（FDA，flourescein Diacetate)它可被活細胞持留而發(fā)出黃綠色熒光；若細胞有損傷則會從細胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細胞膜，但能對固定的細胞及膜有破損的細胞的核進行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide)和溴化乙錠（EB,Ethidium bromide )就是常用的第二類熒光探針。
用FCM來測定活細胞生物功能發(fā)揮方面和性能的指標很多。例如可用來測細胞膜電位、細胞內(nèi)pH值和細胞內(nèi)鈣等，這些都和細胞的激活密切相關(guān)。FCM也可用來測膜結(jié)構(gòu)的流動性或微粘度等。有報告可以用FCM代替51Cr的放射免疫分析來測定天然殺傷細胞（NK, Natu-ral killer cells)對靶細胞毒理學活性的大小。
二、FCM的典型應用簡介
下面簡單介紹FCM在各個領(lǐng)域中應用的典型實例，以求對FCM應用的全面了解，并能深入了解FCM在免疫細胞化學中應用的背景。
1．在細胞生物學方面的應用細胞生物學是FCM應用最廣泛也是最基本的領(lǐng)域，細胞周期分析是其基本分析內(nèi)容之一，而實施的技術(shù)途徑是通過測定細胞周期各時相的DNA含量來達到的。
眾所周知，細胞周期由G1期、S期、G2期和M期所構(gòu)成的。各期細胞的DNA含量如下：G1期為2C，G2期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G1峰的道數(shù)恰好是G2和M峰道數(shù)的一半（圖10-7)。研究表明：對于正常細胞群，各周期時相的細胞數(shù)的比例是同一的；對于惡性病變的細胞群則是非均一的（圖10-8)。
圖10-7 細胞周期的DNA直方圖
圖10-8 細胞周期中的細胞數(shù)目與腫瘤的關(guān)系
臨床腫瘤病學已經(jīng)注意到細胞動力學的重要性。研究工作表明：腫瘤細胞對化療和放療的敏感程度與細胞的增生率高低密切相關(guān)；采取細胞同步化（Cell Synchronization)措施可以提高療效。例如可以使用雌激素這種外源性藥物讓雌激素受體陽性的乳腺癌細胞同步化。
臨床微生物學可以用FCM對大量細菌的DNA和RNA含量進行測量，進行微生物鑒定、醫(yī)學常規(guī)中的細菌抗生素敏感試驗和傳染活性的測定。
FCM優(yōu)良的分析和分選功能在分子遺傳學領(lǐng)域也能充分發(fā)揮。例如流式細胞核型分析技術(shù)就是用FCM對染色體進行分類、純化，檢測或定量測量細胞表面或內(nèi)部由特異基本所編碼的成份。這方面的成果已用在畜類性別的預選擇，以及對人類計劃生育等方面的工作。
2．在免疫學方面的應用 FCM以它的快速、靈活及定量的特點被廣泛地應用于免疫學的基礎(chǔ)研究和臨床應用的各個方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監(jiān)測、機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分�；诿庖呒夹g(shù)是免疫細胞化學分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹FCM在免疫應用中的技術(shù)問題。
�。�1)免疫應用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術(shù)的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線最強。為了擴大儀器對雙標記或三標記染色的熒光信號的分辨范圍可使用雙激光光源。
為了減少細胞由于激光束造成的散射光對光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時測定兩種波長以上的熒光信號，光路中還要使用二向性分光元件。
為了測定伴隨細胞轉(zhuǎn)化過程所產(chǎn)生的早期免疫及生化性質(zhì)的改變，例如膜的流行性，DNA構(gòu)象變化等，可以使用偏振片。
總之，應用于免疫學時要充分考慮有關(guān)光源及光學濾片系統(tǒng)的正確使用。
