熒光抗體是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的重要技術(shù)之一，制備高特異性和高效價(jià)的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性高效價(jià)的免疫血清。
一、熒光素
熒光是指一個(gè)分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時(shí)停止（一般持續(xù)10-7～10-8s)�？梢援a(chǎn)生明亮熒光的染料物質(zhì)，稱(chēng)熒光色素。目前主要常用的熒光色素有以下3種：
（一)異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate, GITC)
呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為398.4（圖3-5)。醫(yī)學(xué) 全在.線提供
在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。反應(yīng)式如下（圖3-6)：
一個(gè)Ig分子上最多能 標(biāo)記15～20個(gè)FITC分子。
圖3-5 FITC的吸收光譜和發(fā)射光譜
圖3-6 抗體的FITC標(biāo)記反應(yīng)式
�。ǘ�)四乙基羅達(dá)明（tetraethylrodamine B200, RB200)
呈褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595～600nm,呈明亮橙紅色熒光。分子量為580（圖3-7)。
RB200在五氯化磷（PCl5)作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SO2Cl)，在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸ε-氨基反應(yīng)結(jié)合而標(biāo)記在蛋白分子上�；瘜W(xué)反應(yīng)式如下（圖3-8)。
圖3-7 RB200在可見(jiàn)光區(qū)的吸收 圖3－8 RB200標(biāo)記抗體反應(yīng)
光譜和熒光光譜
圖3-8 RB200標(biāo)記抗體反應(yīng)
