生殖器皰疹

【概述】　返回

　　生殖器皰疹（herpes genitalis)是由單純皰疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型所致性病之一。近年來發(fā)病率明顯升高。單純皰疹病毒可引起皮膚、粘膜及多種器官感染。它可以通過性接觸感染而發(fā)生生殖器官皰疹。

【流行病學(xué)】　返回

　　目前生殖器皰疹的流行情況在STD中非常引人注意，它已成為歐美最常見的性病之一。如英國自1971年的4000例增至1985年的20000例。在美國，1966-1984年已增加了15倍。估計美國人群累計病例超過3000萬。本病占STD中第5位（7.7%)。在歐美國家中占5%-10%，特別是最近由于性行為多樣化，口腔性行為的普遍，生殖器從口腔感染HSV相對增多。另外還有一個背景，即對HSV無免疫，故成人感染增加。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，90%生殖器皰疹病例是由HSV-2型引起，10%由HSV-1型引起。世界各地HSV-2型患病率顯著增加，臨床所見的生殖器皰疹患者中，年齡最小者16歲（女)，最大者為69歲（男)，無論男或女均以20-30歲年齡組，發(fā)病率最高，其比率分別是38%（男)和52%（女)。在美國大學(xué)生中，HSV-2血清流行率僅2%-4%，而家庭診所就診者則高達(dá)25%~30%。在美國總?cè)丝谥薪?0年HSV-2血清流行率增加了1/3，達(dá)23%。在發(fā)展中國家，HSV-2血清流行率更高，如烏干達(dá)婦女保健診所高達(dá)41%，秘魯STD中心為83%。在我國近幾年生殖器皰疹也明顯增加。但發(fā)病率沒有詳細(xì)統(tǒng)計。

　　人群中HSV感染較為普遍，人是皰疹病毒的自然宿主。主要傳染源是生殖器皰疹患者和無癥狀的病毒攜帶者。追查男性的傳染源，近半數(shù)歸咎于嫖妓，其他幾乎來自各種類型的不潔性行為的性濫者。生殖器皰疹患者是在與性伴的性接觸中感染上本病的，而這些性伴通常不知道自己已患上了生殖器皰疹。這就是生殖器皰疹廣泛蔓延的原因之一。

　　HSV-1常由飛沫和唾液傳播，而HSV-2幾乎都是性接觸傳播。

【病原學(xué)】　返回

　　單純皰疹病毒屬于病毒科，直徑180nm，是較大的DNA病毒。它可以分為HSV-1和HSV-2兩個亞型，它們在生物學(xué)、自然屬性以及人類對它們的免疫方面存在著不同。但這兩個亞型感染引起的病理生理卻相同。HSV的核酸結(jié)構(gòu)為雙股線狀DNA，每股DNA分長、短兩個部分。分子量約為100×106道爾頓，15萬鹼基對，可編碼60個以上的基因產(chǎn)物。在DNA病毒中，單純皰疹病毒基因結(jié)構(gòu)具有特殊性，因為它的兩個獨立的核苷酸序列兩側(cè)有倒置的重復(fù)序列，這兩個核苷酸序列能夠互相倒置聯(lián)系，病毒DNA有四種異構(gòu)體。HSV-1和HSV-2的病毒基因有50%左右的同源性。

　　HSV病毒形態(tài)呈球形，病毒核衣殼表面是由162個殼微粒組成的對稱20面體（100-110nm)，其內(nèi)是由DNA組成的核心，蛋白質(zhì)外殼包繞著病毒基因組，外面有一層脂膜。在衣殼和包膜之間是一種多蛋白組成的被膜。HSV有三類基因，分別為α、β和γ基因。HSV感染神經(jīng)細(xì)胞但不造成細(xì)胞死亡，病毒在感染細(xì)胞內(nèi)處于抑制狀態(tài)，被感染細(xì)胞的存活與功能也不受影響，把這一過程稱為潛伏。病毒基因激活后病毒開始復(fù)制，有時可形成皰疹性損害，這一過程稱為復(fù)發(fā)。潛伏感染神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)有大量的兩種RNA轉(zhuǎn)錄體，它們與稱作ICP-O的直接早期（α)基因產(chǎn)物重疊，這些RNA轉(zhuǎn)錄體按“反義”方向編碼，表示它們可能是β和γ蛋白轉(zhuǎn)錄的抑制因子，當(dāng)病毒處于潛伏狀態(tài)時，其復(fù)活能力也被降低，對病毒潛伏的分子機(jī)理的了解可能有助于為預(yù)防HSV復(fù)發(fā)找到新途徑。

【發(fā)病機(jī)理】　返回

　　HSV主要經(jīng)過皮膚、粘膜或破損處進(jìn)入人體內(nèi)，首先在表皮或真皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。不論有無臨床癥狀，病毒在局部充分復(fù)制后感染感覺神經(jīng)或自主神經(jīng)未稍。病毒沿神經(jīng)軸索進(jìn)入神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞中。動物實驗發(fā)現(xiàn)，從皮膚粘膜接種HSV到神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)病毒，大約2天時間，可見其感染速度相當(dāng)快。

　　HSV-1通常由呼吸道、消化道及皮膚粘膜密切接觸感染。所以HSV-1常潛伏在三叉神經(jīng)根和頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)。故臨床所見主要是顏面部位的皰疹，HSV-2主要因性行為傳播，生殖器接觸而感染，所以HSV-2則常潛伏在骶神經(jīng)節(jié)內(nèi)，故臨床主要表現(xiàn)為生殖器皰疹。患者血清學(xué)均為陽性，可終生有泌尿生殖道HSV間歇性活動。

　　感染最初階段，病毒先在神經(jīng)節(jié)及與之相接觸的神經(jīng)組織內(nèi)復(fù)制，然后通過感覺神經(jīng)到達(dá)其未稍而使與之相關(guān)的皮膚、粘膜表面發(fā)生皮損。病毒從外周感覺神經(jīng)擴(kuò)散到皮膚、粘膜，這一情況，可以解釋表皮大面積受感染和遠(yuǎn)離原發(fā)部位新病損發(fā)生的原因。原發(fā)性HSV感染病人常有這些特點，而且從遠(yuǎn)離接種部位的神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)病毒。初次發(fā)病臨床癥狀消退后，在神經(jīng)內(nèi)不再分離到感染性病毒。在細(xì)胞表面也檢不出病毒蛋白。各種刺激因素，如免疫抑制、勞累、感染、精神創(chuàng)傷以及皮膚神經(jīng)節(jié)創(chuàng)傷等都可引起病毒復(fù)活。

　　原發(fā)感染緩解后，神經(jīng)節(jié)中找不到感染的病毒和病毒結(jié)構(gòu)蛋白，潛伏感染神經(jīng)細(xì)胞中的病毒基因組和顯性感染不同，前者HSV的DNA是環(huán)狀的，在潛伏感染的小鼠神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)和人的三叉神經(jīng)節(jié)中檢出的RNA轉(zhuǎn)錄物中可與編碼早期基因ICPO的區(qū)域雜交，此RNA是編碼ICPO的DNA互補鏈轉(zhuǎn)錄來的。此“反義”RNA可能參與維持神經(jīng)內(nèi)潛伏感染但不參與建立潛伏感染，維持潛伏感染的機(jī)制不清楚，似乎潛伏感染的細(xì)胞僅有HSV蛋白質(zhì)的部分轉(zhuǎn)錄。 醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

【病理改變】　返回

　　表皮細(xì)胞發(fā)生氣球樣變性，其中可見有嗜酸性包涵體。表皮開始為網(wǎng)狀變性形成的多房性水皰，以后聚合為單房性水皰。真皮乳頭層有輕度水腫，有輕重不等炎性細(xì)胞浸潤。反應(yīng)嚴(yán)重時可有嚴(yán)重血管炎表現(xiàn)。

【臨床表現(xiàn)】　返回

　　一、癥狀

　　HSV感染是一種全身性疾病，病毒經(jīng)呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進(jìn)入人體，可潛于人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺神經(jīng)節(jié)和多數(shù)器官內(nèi)，幾乎所有的內(nèi)臟和粘膜表皮內(nèi)都可分離到HSV。

　　原發(fā)感染多為隱性，大多無臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn)，僅有少數(shù)（約1-10%)可以出現(xiàn)臨床癥狀。主要見于免疫功能低下嬰幼兒或嚴(yán)重營養(yǎng)不良或有其它感染的兒童，成人罕見。原發(fā)感染消退后，病毒可持續(xù)潛居體內(nèi)。正常人中約有半數(shù)以上為本病毒的攜帶者，可通過口、鼻分泌物而成為傳染源，由于HSV在人體中不產(chǎn)生永久免疫力，故每當(dāng)機(jī)體抗病能力減退時，如患某種發(fā)熱性傳染病，胃腸功能紊亂、月經(jīng)、妊娠、病灶感染、過度疲勞、情緒環(huán)境改變時，體內(nèi)潛伏的HSV即被激發(fā)而發(fā)病。

　　HSV-1主要引起口唇皰疹，咽炎，角膜結(jié)膜炎和散發(fā)性腦炎，而HSV-2感染主要引起生殖器皰疹，但在臨床上也有相反情況。

　　HSV感染的潛伏期為1～45天，平均為6天，HSV-1感染主要發(fā)生于口角、唇緣、鼻孔等皮膚粘膜交界處，亦可見顏面或口唇，開始局部先有灼癢及輕度緊張感，偶有伴發(fā)神經(jīng)痛。隨即出現(xiàn)紅斑，在紅斑基礎(chǔ)上發(fā)生簇集性小丘疹，迅速變?yōu)樗诹Ｖ?a class="channel_keylink" href="/pharm/2009/20090113045329_89063.shtml" target="_blank">綠豆大小的水皰，內(nèi)容澄清，水皰破裂后出現(xiàn)糜爛面，數(shù)日后干燥結(jié)痂。自覺灼癢，偶有倦怠，不適和輕微發(fā)熱等全身癥狀，愈合可遺留暫時性色素沉著。全病程1-2周左右。

　　HSV-2感染主要發(fā)生于生殖器部位，患部先有燒灼感，很快在紅斑的基礎(chǔ)上發(fā)生成群的小水皰，多見男性包皮、龜頭、冠狀溝、陰莖等處，偶見于尿道；女性常見于陰唇、陰蒂、陰道、宮頸等處。水皰可逐漸變成膿皰，約6天左右破潰而形成糜爛或淺的潰瘍，自覺疼痛。病人可發(fā)生尿道炎，出現(xiàn)排尿困難。多數(shù)人有腹股溝淋巴結(jié)腫大疼痛，有的病人可出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉痛及腦膜炎癥狀。如發(fā)于女性宮頸者可形成潰瘍壞死，陰道分泌物增多，可有下腹痛。應(yīng)注意有無宮頸癌發(fā)生。孕期患生殖器皰疹時易致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎，并易使新生兒感染，發(fā)生新生兒單純皰疹。本病一般經(jīng)過3周左右可以痊愈，但常有反復(fù)發(fā)作，一般原發(fā)疹后1-4個月內(nèi)復(fù)發(fā)，癥狀較原發(fā)者輕，范圍亦小，局限于生殖器部位，有時僅有1-2個皰疹，病程亦短，自發(fā)病至愈合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染，如口唇、臂部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。

Herpes Genitalis

　　二、體征

　　皮損為紅斑基礎(chǔ)上可見成群的水皰或膿皰或成糜爛及潰瘍。女性患者約90%伴有HSV宮頸炎，宮頸可見發(fā)紅、糜爛、潰瘍，有膿性陰道分泌物。有的患者可有腹股溝淋巴結(jié)腫大壓痛或體溫升高。皮膚病變也可出現(xiàn)在口唇、手指、臀部、大腿、手臂，甚至眼部與咽喉。并發(fā)腦膜炎或橫貫性脊髓炎，一般于發(fā)疹后3-12天出現(xiàn)頸項強(qiáng)直等顱內(nèi)壓增高的現(xiàn)象。

　　三、潛伏感染和復(fù)發(fā)

　　HSV感染人體后1周左右，血中出現(xiàn)中和抗體，3-4周達(dá)高峰，可持續(xù)多年，這些抗體能清除病毒和使機(jī)體康復(fù)，但大多數(shù)個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復(fù)發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi)。不同亞型HSV感染者急性首發(fā)生殖器皰疹的臨床過程相似，但生殖器病變復(fù)發(fā)率不同，首發(fā)HSV-2感染者約90%，在12個月內(nèi)會出現(xiàn)一次復(fù)發(fā)（平均復(fù)發(fā)4次)，而初次感染HSV-1者僅50%出現(xiàn)類似復(fù)發(fā)（平均復(fù)發(fā)次數(shù)小于1)。不同個體及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的復(fù)發(fā)率變化很大，大多數(shù)年復(fù)發(fā)5-9次，一般在原發(fā)皰疹消退后1-4個月內(nèi)發(fā)生，有些患者受到促發(fā)因素，如發(fā)熱、月經(jīng)、日曬、寒冷、某些病毒感染等的影響而復(fù)發(fā)，其特點是每次復(fù)發(fā)往往發(fā)生在同一部位，復(fù)發(fā)前可有前驅(qū)癥狀如局部瘙癢，發(fā)疹前數(shù)小時感染部位有灼燒，麻刺感。

　　復(fù)發(fā)生殖器皰疹（GH)對患者心理影響較大，由于目前尚無預(yù)防復(fù)發(fā)的有效療法及可能有誘發(fā)生殖器惡變的危險性，故給患者帶來心理影響，患者多有抑郁、恐懼等心理障礙，這又直接影響HSV的復(fù)發(fā)。我們的治療經(jīng)驗，只要患者堅持規(guī)律治療，都能治愈。 醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

　　四、HSV與HIV感染：

　　HSV常與HIV-1同時感染，并能促進(jìn)病情發(fā)展，引起嚴(yán)重的局部和播散性感染。目前認(rèn)為HSV是一種調(diào)節(jié)因素，能激活HIV復(fù)制，Heng對6例AIDS合并生殖系統(tǒng)HSV皮膚損害患者進(jìn)行皮膚活檢，發(fā)現(xiàn)角化細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有HIV-1和HSV-1雜交后使HIV-1保留其感染性，而無需與CD4分子結(jié)合即能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外HSV-1能刺激潛伏型HIV-1，而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在組織中的復(fù)制。

【診斷】　返回

　　HSV感染的診斷要依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現(xiàn)皮膚紅斑和原發(fā)性水皰，易復(fù)發(fā)等不難診斷。必要時可作皰液涂片，培養(yǎng)、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測定等，均有助于診斷和確定病毒類型。

　　一、細(xì)胞學(xué)方法

　　對皮損刮片做Wright-Gemsa （Tzanck試驗)或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特征的巨細(xì)胞包函體，但不能區(qū)別HSV感染或水痘 — 帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅為病毒分離的60%。

　　二、培養(yǎng)法

　　從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術(shù)條件要求高，價格昂貴，不能普遍使用。

　　三、抗體檢測

　　目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點。

　　四、基因診斷

　�。ㄒ�)用PCR分型檢測單純皰疹病毒

　　PCR是一種敏感性高，特異性強(qiáng)的快速檢測方法，標(biāo)本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發(fā)展較快，且分型檢測HSV是發(fā)展的趨勢。

　　1、標(biāo)本采集和處理

　　（1)標(biāo)本采集

　�、倌X脊液：直接無菌采取患者0.5ml腦脊液標(biāo)本于無菌試管送檢.如肉眼可見血色,應(yīng)離心取上清。

　�、谘蛩�及嬰兒血清：同上,應(yīng)避免溶血.

　�、勰X組織：腦組織尸檢、活檢標(biāo)本，加1ml PBS標(biāo)本緩沖液研磨后，待檢。

　　④眼及皮膚病灶分泌物：用預(yù)測（半干)棉拭子直接取患處分泌物， 置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。

　�、萆�殖器（宮頸、陰道、外陰、陰莖)標(biāo)本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預(yù)潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。

　�。�2)標(biāo)本處理

　　①預(yù)處理：所有液體標(biāo)本均可直接進(jìn)行模板制備；可以取100μl標(biāo)本液，離心5000 r/ min×5min后，去上清，取沉淀物進(jìn)行模板制備。

　�、谀０逯苽洌篴：蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h后，煮沸10 min，離心5000 r/ min×5min，收集上清。 b：水煮法：沉淀物加100μl蒸餾水，搖均水煮20 min，離心5000 r/ min×5min收集上清。c：1%Triton　X-100裂解法:取采集的標(biāo)本液100μl，加入1μl Triton　X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d：5%NP-40裂解法：取采集的標(biāo)本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ min×5min收集上清。e：如標(biāo)本溶血嚴(yán)重經(jīng)上述裂解處理后，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μl DW溶解待檢。

　　2、PCR擴(kuò)增

　　（1)引物設(shè)計。以HSV DNA聚合酶的高保守區(qū)為檢測靶序列以確保特異性。設(shè)計3個引物，一個上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′)：二個下游特異性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　)和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′)，可以分別擴(kuò)增出HSV-1 469bp DNA片段（1981～2359)、HSV-2 391bp片段（1561～1953)：從二型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中設(shè)計了一個不分型的特異性探針HSVP3　 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。

　　（2)PCR實驗體系。取模板10μl： DNAP5　 0.5（0.2μmol/L)：DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2　0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP 8μl(4×200μmol/L)；10×緩沖液10μl：DMSO 4μl；加DW 65.5μl； 石蠟油 30μl.。

水煮（96℃～100℃)7min

加TaqDNA聚合酶1μl；（2.5U)

72℃4 min ↓ 95℃40s ↓ 65℃60s　→　72℃70s 　↓　　33個循環(huán) 70℃4 min

　　3．?dāng)U增產(chǎn)物的檢測和分析

　　（1)瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加樣品緩沖液4μl混勻后，點樣于2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠（EB)染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果在溴酚藍(lán)后面有一條或二條亮紅帶為陽性結(jié)果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。

　�。�2)XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產(chǎn)物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產(chǎn)生46bp片段帶（引物后面)；與正常PCR產(chǎn)物比較，XhoI酶切后的大片段電泳位置前移。

　�。�3)Southern印跡法：PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90 min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2 h，42℃預(yù)雜交（雜交液中)30 min， 加入32p標(biāo)記HSVP3探針后,42℃雜交過夜；次日用1%SDS/ PBS pH7.2,　42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min; 膜置X線暗盒內(nèi)放射性自顯影12～15h，顯影為陽性，不顯影為陰性。 醫(yī).學(xué) 全在.線,提供www.med126.com

　�。ǘ�)套式PCR

　　套式PCR（nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR)是通過“外側(cè)”、“內(nèi)側(cè)”兩對引物，即一對擴(kuò)增較大DNA片段的“外側(cè)”引物和一對位于擴(kuò)增產(chǎn)物中再擴(kuò)增小片段的“內(nèi)側(cè)”引物，這樣兩次連續(xù)放大可以提高PCR檢測的靈敏度，保證產(chǎn)物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應(yīng)改進(jìn)分型檢測HSV，更好地在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中推廣應(yīng)用。

　　1、標(biāo)本處理：

　�。�1)標(biāo)本采集同上

　　（2)DNA 制備：①腦脊液：取100μlCSF 水煮15min,加入250μl無水乙醇，放-30℃10 min；離心10000g30 min，去上清，30℃干燥后，加入10μl DW； ②腦組織細(xì)胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10 min；取上清加入等體積酚一氯仿（V/V)，輕搖10 min，離心10000r/ min×10 min;取水相，加入250μl DW溶解。

　　2、PCR擴(kuò)增

　　(1)引物設(shè)計：選擇HSV1糖蛋白D基因為檢測靶基因。

NP-PCR 的引物和探針序列

　　(2)PCR實驗體系和程序：反應(yīng)體積為50μl；模板10μl；BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L)；BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L)；10×緩沖液5μl；4×dNTP 4μl(4×200mmol/L)；DW 27μl；石蠟油30μl。循環(huán)參數(shù)為95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循環(huán)20次，取其擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應(yīng)體系中進(jìn)行套式擴(kuò)增，先95℃變性2min，循環(huán)參數(shù)為95℃30s；5℃30s；72℃60s；循環(huán)30次后，72℃延伸5 min。

　　(3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析：

　�、侪傊�糖凝膠電泳染色法：

　　取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl點樣于2%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15-20min,溴化乙錠染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果，在溴酚蘭后面有一條，或二條亮紅條帶為陽性結(jié)果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。

　　②Southern印跡法：

　　PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預(yù)雜交（雜交液中)30min，加入32P標(biāo)記HSV探針后，42℃雜交過夜，次日用1%SDS/PBS pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min；膜置X線暗盒內(nèi)，放射性自顯影12-15h，顯影為陽性，不顯影為陰性。

　　（三)聚合酶鏈反應(yīng)—酶譜法（polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC)

　　具有經(jīng)濟(jì)廣泛等特點；不僅能一次性分型檢測HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無放射線損傷，易被實驗室接受�？蓹z出3個CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染第1dCSF中HSV DNA陽性結(jié)果，并可用于藥物治療效果的評價。由于病毒的變異性，會出現(xiàn)酶切點突變丟失現(xiàn)象，從而造成酶切陰性結(jié)果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決。

　　1.標(biāo)本處理

　　（1)標(biāo)本采集，方法同上。

　�。�2)DNA模板制備：每份標(biāo)本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h；

　　加入等體積的酚—氯仿（v/v)輕搖10min，離心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍體積)無水乙醇，-20℃過夜沉淀DNA，離心15000r/min×5min,吸去液體，30℃干燥后,加蒸餾水25μl溶解，待檢。

　　2.引物設(shè)計：

　　P1　5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

　　P2　5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

　�。�1)PCR實驗體系：

　　反應(yīng)體積100μl； 模板10μl；P1 0.5μl(10pmol/L)，P2 0.5μl(10pmol/L)；4×dNTP 4μl(4×200mmol/L)；10×緩沖液10μl，DMSD 5μl，DW 65μl，循環(huán)參數(shù)為94℃60s；60℃60s；72℃60s；循環(huán)40次72℃延伸4min。

　�。�2)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與酶切分型.

　�、俚谝徊诫娪捐b定：取10μlPCR產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液,加入2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外燈下觀察,可初步鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

　�、诿盖蟹治觯悍謩e取20μlPCR產(chǎn)物于2個Eppendorf管中，加入50μl無水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應(yīng)緩沖液溶解，加入SmaI或BamHI 50U于相應(yīng)Eppendorf管內(nèi)，37℃作用1h。

　�、鄣诙�步電泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩沖液，加到2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳,15-20min后，EB染色5min,與同步加入未酶切的PCR產(chǎn)物相對照。紫外燈下觀察，結(jié)果如下：

PCR-EC法檢測四種病毒結(jié)果

　�。ㄋ�)用RT-PCR檢測單純皰疹病毒

　　RNA的聚合酶鏈反應(yīng)（RNA-PCR)，可能通過檢測HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利于HSV的潛伏期感染機(jī)制的深入研究。

　　RT-PCR是以RNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT)產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以達(dá)到檢測目的。因此，RNA-PCR也可稱為RT-PCR。

　　1、標(biāo)本處理：

　　組織塊細(xì)胞總RNA提取，取100mg組織標(biāo)本，加1ml硫氰酸胍變性液，于勻漿器中，室溫研磨均勻后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc，1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻，用力振搖10s，置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質(zhì))加入等體積異丙醇置-20℃1h，沉淀RNA。離心 15000r/min×10min,棄上清，RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解，再加0.3ml異丙醇沉淀，-20℃1h，沉淀RNA. 離心15000r/min×10min，去上清，沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次，真空干燥。.加10μl TE緩沖液（pH7.4)溶解,低溫保存?zhèn)溆?臨用前冰浴溶解。

　　2、PCR擴(kuò)增：

　�。�1)引物設(shè)計：選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因。設(shè)計2個引物，

　　P1　5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT　3′

　　P2　5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG　3′可以擴(kuò)增ICPO 中266bp序列。

　　1個探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

　�。�2)PCR實驗體系： 總反應(yīng)體積為50μl，模板10μl （0.25-1.0μg)P1　1μl (20pmol/L)；P2　1μl (20pmol/L)；4×dNTP 4μl（200μmol/L)；10×緩沖液5μl；AMV(逆轉(zhuǎn)錄酶) 2μl (50U)； DW 26μl；循環(huán)參數(shù)，94℃變性2min后 94℃50s，60℃60，72℃60s，循環(huán)40次后72℃延伸5min。

　　3、擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：

　�。�1)瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加4μl 樣品緩沖液，混勻后加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴(kuò)增條帶。

　�。�2)Southern印跡雜交法：用32P標(biāo)記的特異性探針檢測PCR產(chǎn)物，方法同上。

　　總之，在HSV感染性疾病的臨床診斷中，PCR能對前病毒或潛伏期低復(fù)制的HSV特異性靶DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增檢測，遠(yuǎn)較DNA探針敏感，并能在血清中抗體出現(xiàn)前就可以檢出。因此，PCR無論是作為基礎(chǔ)研究手段，還是作為臨床檢驗診斷方法，均具有廣闊的前景。醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站52667788.cn

　　五、病理組織學(xué)診斷

　　細(xì)胞內(nèi)水腫，基底層形成大水皰，病灶周圍有多核巨細(xì)胞浸潤，特別是多核白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞充斥于病灶中間。

【鑒別診斷】　返回

　　主要與硬下疳，軟下疳鑒別：硬下疳為單個質(zhì)硬的潰瘍，無疼痛感，無復(fù)發(fā)史，實驗檢查USR（+)或RPR（+)，梅毒螺旋體可見。軟下疳為質(zhì)軟的潰瘍，局部雖有疼痛感但無復(fù)發(fā)史，實驗檢查鏈桿菌陽性。

　　其他生殖器部位皮膚病如接觸性帶狀皰疹、白塞病。膿皰病有時與生殖器皰疹相似，可以從病史及檢查方面相區(qū)別。

【治療措施】　返回

　　本病有自限性，約1-2周即可自愈。治療的目的是防止下次復(fù)發(fā)。本病目前尚無特效藥物，治療原則為縮短病程，防止繼發(fā)感染，減少復(fù)發(fā)。

　　1．局部療法：原則為干燥、收斂、保護(hù)患部，防止繼發(fā)感染。可外涂2%龍膽紫溶液，或選用10%次沒食子酸鉍（代馬妥dermatol)、氧化鋅油膏或泥膏、紫草生地榆油膏、0.5%新霉素軟膏、或0.25%~0.1%皰疹凈（IDU)軟膏、5%皰疹凈二甲基亞砜溶液（用于皮膚皰疹)等。對顏面部者亦可用10%醋酸鋁或鋅銅合劑。

　　2．全身治療：治療原則其一使感染的HSV不能活化，甚至消滅病毒；其二調(diào)節(jié)免疫，防止再發(fā)，可用阿昔洛韋靜滴或口服，麗珠威口服，干擾素肌注，白細(xì)胞介素Ⅱ肌注。我們在治療復(fù)發(fā)性生殖器皰疹時，使用四醫(yī)大生物技術(shù)中心產(chǎn)的干擾素300萬單位肌注，每日一次，10次為一療程，共三個療程，適當(dāng)配合使用白細(xì)胞介素Ⅱ或利百多或靈桿菌素，95%的病人不復(fù)發(fā)。

　　下面介紹別人治療皰疹方法供參考：

　　一、抗HSV藥物

　�。ㄒ�)無環(huán)烏苷是公認(rèn)的有效藥物：

　　1．原發(fā)和初發(fā)感染：ACV200mg，每日5次，連服7天；或ACV 5mg/kg，按體重靜注，8小時一次，連續(xù)5-7天。

　　2．復(fù)發(fā)感染時，ACV 200mg，每日5次，連服5天，或ACV800mg，每日2次，連服5天；若在剛開始出現(xiàn)前驅(qū)癥狀時或在損害出現(xiàn)后的2天內(nèi)即開始治療，則對部分患者可能有效

　　3．復(fù)發(fā)頻繁時：ACV200mg，每日3次，可連續(xù)服用6-12個月。在經(jīng)常復(fù)發(fā)的患者中（每年>6次)，每日治療至少可以減少75%的復(fù)發(fā)次數(shù)，在接受長達(dá)3年治療的人群，已確定是安全有效的。從接受治療的人群中已分離到耐ACV的HSV株，但免疫功能正常者未見治療失敗者。治療1年后應(yīng)停藥，以便重新評價患者的復(fù)發(fā)率。

　　4．免疫受抑制患者：首發(fā)或復(fù)發(fā)的急性患者：靜注ACV（5mg/kg/8h)或口服ACV400mg×4次/日，共7-10天；抑制復(fù)發(fā)：每天靜注ACV（5mg/kg/8h)或口服ACV（400mg×3-5次/天)，可預(yù)防復(fù)發(fā)。

　　5．HSV直腸炎，ACV 400mg，每日5次，可縮短病程。免疫受抑制或重癥者可靜注ACV5mg/kg/8h。

　　6．新生兒HSV：現(xiàn)有資料認(rèn)為，不應(yīng)該常規(guī)應(yīng)用ACV治療通過產(chǎn)道感染的無癥狀嬰兒，治療僅限于有HSV臨床表現(xiàn)及產(chǎn)后病毒培養(yǎng)陽性的患兒。所有新生兒HSV感染者應(yīng)接受ACV或阿糖腺苷治療。常采用ACV300mg/kg/d，阿糖腺苷30mg/kg/d，靜脈注射共10-14天。

　　7．合并HIV感染：患者需口服ACV間歇或每日抑制治療。對合并HIV感染者增加ACV劑量是十分有益的。

　　ACV400mg，口服，每日3-5次，治療有效，應(yīng)持續(xù)用藥直至臨床癥狀消失；對重癥者，應(yīng)用ACV靜脈給藥，對可疑或已證實的ACV耐藥株引起的重癥患者，最佳方案可能是：ACV400mg/kg，靜脈注射，每8小時一次，直至臨床痊愈。 醫(yī).學(xué)全.在.線52667788.cn

　　HIV感染者中的皮膚損傷粘膜HSV感染時大劑量ACV治療無反應(yīng)者日益增多。大劑量ACV對部分患者有助于損傷的愈合，但不能阻止另外一些患者的病情進(jìn)展。對復(fù)發(fā)頻繁者長期服用ACV不能制止繼續(xù)排毒，因此，仍可對性伴感染，此時若改用作用機(jī)理不同的抗病毒藥物如磷甲酸和阿糖腺苷等可能有效。

　　ACV的抗病毒機(jī)理是它很容易被HSV編碼的胸苷激酶磷酸化，形成ACV-MP，再被細(xì)胞激酶作用而形成ACV-TP。ACV-TP與dGTP競爭而抑制病毒DNA合成。

　　ACV全身應(yīng)用治療首次臨床發(fā)作或作為抑制治療藥物時，可使皰疹發(fā)作的癥狀和體征得到控制。然而，該藥既不能根除潛伏病毒感染，也不能影響以后發(fā)作的次數(shù)和嚴(yán)重性。該藥局部治療的效果比口服差，故不提倡局部用藥。

　　ACV可縮短生殖器皰疹病程，加速愈合及緩解癥狀，長期應(yīng)用可減少復(fù)發(fā)，曾有人對11000例免疫正常的GH連續(xù)治療5年，在此期間復(fù)發(fā)率明顯降低。

　　但是長期口服ACV不能清除骶神經(jīng)節(jié)的潛伏病毒，停藥后生殖器皰疹仍可復(fù)發(fā)，對ACV有耐藥性的病毒株越來越多，幾乎所有耐藥性都發(fā)生于曾經(jīng)進(jìn)行多個病程治療的免疫受損害者。

　　ACV靜脈應(yīng)用的主要副作用是由于藥物在腎實質(zhì)內(nèi)結(jié)晶而引起的暫時性腎功能不全。若緩慢給藥一小時以上或大量飲水則可避免此副作用。

　�。ǘ�)病毒唑（三氮唑核苷，Ribavin RBV)：抑制病毒多種DNA及RNA復(fù)制，合成。

　　用量：原發(fā)GH及AIDS合并HSV感染，15mg/kg/d，肌注；復(fù)發(fā)GH，0.4g,口服,每日4次,3天后改為0.4g,每日2次,共5天,療效肯定,用于耐藥病毒株。

　�。ㄈ�)磷甲酸（Trisodium Phosphonoformate，PFA)；選擇性抑制皰疹病毒誘導(dǎo)的DNA依賴的DNA聚合酶，主要用于耐ACV病毒株的感染。

　　用量：40-60mg/kg/d，靜脈注射，每8小時1次，連用4次，可用于AIDS合并HSV感染。外用0.3%-1%PFA霜。副使用有腎毒性及鈣磷代謝紊亂。

　�。ㄋ�)雙羥丙氧甲基烏苷（更昔洛韋，Ganciclovir，DNPG)：是ACV的衍生物，通過抑制病毒DNA復(fù)制，導(dǎo)致RNA合成受阻，感染細(xì)胞DNA多聚酶是作用的靶部位。

　　用量：5-10mg/kg/d，分3次靜注，連續(xù)14天，副作用有造血系統(tǒng)抑制及肝損害。

　�。ㄎ�)氟阿糖碘胞苷（FIAC)：對HSV-1和HSV-2有同樣作用，選擇性作用于被病毒感染的細(xì)胞，其代謝產(chǎn)物5-碘尿嘧啶、5-甲尿嘧啶均有抗病毒作用。阿糖腺苷磷酸抑制病毒DNA合成，有廣譜抗病毒活性，副使用少，不能防止?jié)摲�感染的建立，但防止病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定保護(hù)作用�？笻SV單克隆抗體局部外用，對GH有治療作用，國外有人報道治療HSV-2總有效率92.6%，基本治愈率44.1%。

　　（六)消炎痛（Indomethacin)：作用為抑制前列腺素合成，有助于減少GH的復(fù)發(fā)，促進(jìn)conA及PHA（植物血凝素)刺激所發(fā)生的細(xì)胞增殖作用，加強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，可用于復(fù)發(fā)GH的治療，用量：25mg口服，每日3次。

　�。ㄆ�)聚肌胞（Poly ZIC)：是人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，能刺激吞噬作用，增強(qiáng)抗體形成，對免疫系統(tǒng)起調(diào)節(jié)使用。用量2mg，肌注，2-3次/周。

　　二、對妊娠GH的處理

　　對孕婦使用無環(huán)鳥苷的安全性尚未肯定，但研究發(fā)現(xiàn)，用ACV的孕婦畸胎發(fā)生率與正常人相比，并無增高，但ACV對妊娠及胎兒的危險性尚未得出可靠結(jié)論。

　　對威脅母親生命的HSV感染，如腦炎，肺炎及肝炎，應(yīng)采用ACV靜脈用藥，但無威脅生命的HSV感染，不必全身用ACV治療。

　　依照美國傳染病學(xué)會建議，對妊娠期反復(fù)發(fā)作的GH處理方案如下：

　�。ㄒ�)分娩時如無活動性生殖器損害，則無需剖腹產(chǎn)；

　�。ǘ�)妊娠未3個月，癥狀性復(fù)發(fā)是短暫的，只要分娩時無活動性損害，可經(jīng)陰道分娩。

　　（三)臨產(chǎn)時有活動GH者，可作如下處理：①羊膜未破，孕婦不發(fā)熱，胎兒尚未成熟，應(yīng)延緩分娩；②如系足月妊娠，羊水已破，胎兒肺已成熟，應(yīng)行剖腹產(chǎn)。

【預(yù)防】　返回

　�。ㄒ�)避免不潔性交及不正當(dāng)?shù)男躁P(guān)系，活動性生殖器瘡疹患者絕對禁止與任何人發(fā)生性關(guān)系；

　�。ǘ�)治療期間禁行房事，必要時配偶亦要進(jìn)行檢查；

　�。ㄈ�)對局部損害的護(hù)理，應(yīng)注意保持清潔和干燥，防止繼發(fā)感染；

　�。ㄋ�)治愈后或有復(fù)發(fā)者，要注意預(yù)防感冒，受涼，勞累等誘發(fā)因素，以減少復(fù)發(fā)。

　　目前尚無特異性預(yù)防方法，動物實驗表明，接種HSV死疫苗或減毒活疫苗，均有免疫效果，因此病毒與某些癌癥的關(guān)系密切，故不作常規(guī)預(yù)防使用。最近用純化的皰疹病毒包膜糖蛋白作疫苗，可避免皰疹病毒DNA的致癌危險性。

　　ACV也有預(yù)防作用。陰莖套可能減少疾病的傳播，尤其是在無癥狀排毒期，但出現(xiàn)生殖器損害時，使用陰莖套也不能避免傳播。