實驗六 環(huán)境因素對微生物的影響
微生物的生長繁殖是通過與外界環(huán)境進行物質(zhì)和能量交換而實現(xiàn)的，若周圍環(huán)境的改變過于劇烈，導致細菌的主要代謝機能發(fā)生障礙，或菌體蛋白質(zhì)發(fā)生變性凝固，則微生物的生長被抑制或微生物死亡。
環(huán)境因素從總體上可分為物理、化學、生物和營養(yǎng)四大類。實驗工作中常用適宜的物理或化學方法以達到消毒滅菌的目的。
一、物理因素對細菌的影響
（一)熱力消毒與滅菌
【原理】
高溫對細菌有明顯的致死作用，主要機理是凝固菌體蛋白質(zhì)，也可能與細菌DNA單螺旋斷裂、細菌膜功能受損及菌體內(nèi)電解質(zhì)濃縮有關。
濕熱滅菌所需溫度較低，時間較短(表6-1)。特別是高壓蒸氣滅菌，因增加壓力而提高溫度，滅菌效果最佳。其主要優(yōu)點是：①溫度較高，滅菌所需時間較短；②蒸氣穿透力強；③蒸氣冷凝時釋放汽化熱，能迅速提高物品的溫度；④物品并不過分潮濕。
表6-1 熱力消毒滅菌法比較
方法 溫度(℃) 時間(min) 滅菌器
焚燒 ＞500瞬時
干烤 160～170 干熱滅菌器
巴氏消毒法 61.1～62.8 20
煮沸消毒法 100 5
流通蒸氣消毒法 100 15～30 流通蒸氣滅菌器
間歇滅菌法 100 30流通蒸氣滅菌器(重復3次)
高壓蒸氣滅菌法 121 15～30 高壓蒸氣滅菌器
【材料】
1．枯草桿菌、大腸桿菌肉湯12h培養(yǎng)物。
2．肉湯培養(yǎng)基、瓊脂平板。
3．水浴鍋、電爐、鋁鍋、高壓蒸氣滅菌器、溫度計、無菌毛細吸管等。
【方法】
1．將8支肉湯管分成甲、乙、丙、丁4組，每組2支，分別標注2種菌名。
2．用無菌毛細吸管分別在肉湯管內(nèi)接種相應的菌種液2滴。
3．將甲組2管置60℃水浴30min，乙組2管置100℃水浴5min，丙組2管置高壓蒸氣鍋內(nèi)121℃15～30min，丁組2管不作任何加熱處理(對照)。
4．將4組肉湯管置37℃培養(yǎng)18～24h后，觀察結果。
【結果】
記錄各管細菌的生長情況(表6-2)。
表6-2 細菌生長情況
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細 菌 甲組(60℃30min) 乙組(100℃5min) 丙組(121℃15min) 丁組(未加熱)
枯草桿菌
大腸桿菌
附：高壓蒸氣滅菌法（示教)
高壓蒸氣滅菌方法的原理是水在大氣中100℃左右沸騰，水蒸氣壓力增加，沸騰時溫度將隨之增加，因此，在密閉的高壓蒸氣滅菌器內(nèi)，當壓力表指示蒸氣壓力增加到15磅(1.05kg/cm)時，溫度則相當于121.3℃，在這種溫度下20min即可完全殺死細菌的繁殖體及芽胞。
1．構造：見下圖
A．桌上型電熱壓力蒸氣滅菌鍋 B．直立型電熱壓力蒸氣滅菌鍋
2．使用法及注意點：把待滅菌之物品放入滅菌室，加足一次滅菌之用水于夾層中。用螺旋固定鍋頂鐵蓋底部，使不漏氣。加熱，水沸后蒸氣沿夾層上升。由洞入內(nèi)筒，當蒸氣初進入內(nèi)筒時應把上下排氣管打開，放出冷空氣后，關閉排氣管。由于蒸氣通入密閉之空間，壓力即上升，從壓力表可以看出，蒸氣還通過安全閥門，以保證壓力維持于一定限度，使壓力維持于15磅20min，然后關閉熱源，使壓力逐漸降低至零，方可打開鍋蓋，否則因壓力驟降，玻璃器內(nèi)之液體會沖出瓶口，發(fā)生外溢或爆炸等危險。
（二)紫外線殺菌
【原理】
波長240～280nm的紫外線，因與DNA吸收光譜一致而有明顯的殺菌作用。其機制是使細菌DNA相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞DNA構型，干擾其正常復制，導致細菌死亡。
紫外線殺菌力雖較強，但穿透力弱，故僅用于實驗室、病房、手術室的空氣和物體表面的消毒滅菌。
【材料】
1．大腸桿菌、枯草桿菌肉湯12h培養(yǎng)物。
2．瓊脂平板。
3．鑷子、無菌棉簽、紫外線燈等。
【方法】
1．用無菌棉簽分別蘸取大腸桿菌和枯草桿菌菌液于2個瓊脂平板上密密涂布。
2．半啟皿蓋(用皿蓋蓋住兩菌涂面的1/2)，置于紫外光燈下20～30cm，照射30min。
3．將皿蓋蓋好，37℃孵育18～24h，觀察結果。
【結果】
皿蓋蓋住的瓊脂表面2種細菌均形成菌苔，直接暴露的瓊脂表面大腸桿菌無菌生長；枯草桿菌僅有少量細菌生長。
（三)濾過除菌
【原理】
濾過除菌是一種機械除菌法，主要用于一些不耐高溫液體的除菌，例如：血清、毒素、抗毒素、藥物等。但此法不能除去病毒、支原體和L型細菌等。
【材料】
1．待濾過的血清肉湯。
2．濾器(已滅菌)和過濾裝置等。
【方法】
1．無菌取1環(huán)待濾血清肉湯接種于肉湯管。
2．將燒瓶中的血清肉湯倒入濾斗，啟動抽氣機，減壓抽濾。濾畢，關閉抽氣機。用吸管吸取瓶中濾液，移置于無菌試管內(nèi)。
3．無菌取1環(huán)濾液接種于另管肉湯。
4．將2管肉湯置37℃培養(yǎng)18～72h，觀察結果。
【結果】
接種待濾血清肉湯的管呈渾濁，接種已濾血清www.med126.com肉湯的管澄清。
二、化學因素對細菌的影響
有些化學藥品濃度高時能殺滅病原微生物，稱為化學消毒劑；濃度低時能抑制細菌生長，稱為防腐劑�；瘜W消毒劑對人體細胞有毒性作用，故只能外用�；瘜W治療劑能選擇性地影響微生物代謝，致使其死亡或抑制其生長，對人體的毒性甚微或全無，故可內(nèi)服或注射。
絡合碘對細菌的作用
【材料與方法】
1．取瓊脂平板1個，將底面分成兩等份，注明①②。
2．用無菌棉簽蘸生理鹽水，在左手食指頭上涂擦。用該指頭在平板①處瓊脂表面涂抹，作為消毒前的對照。
3．用棉簽蘸絡合碘消毒左手食指。待絡合碘干后，依上法在平板②處瓊脂表面涂抹。
4．置平板于37℃培養(yǎng)18～24h。
【結果】
平板①處瓊脂表面有細菌生長；②處不長細菌或出現(xiàn)極少的菌落。說明一定濃度的絡合碘能殺滅細菌。
三、生物因素對細菌的影響
微生物與微生物之間，微生物與動、植物之間，不同程度地存在著拮抗現(xiàn)象。生物之間的這種拮抗作用，可以表現(xiàn)出對細菌的抑制或殺滅作用，即生物因素對細菌的影響。
抗生素(antibiotics)是指某些微生物(大多數(shù)是放線菌和真菌，極少數(shù)是細菌)在生長繁殖過程中，產(chǎn)生的能抑制或殺滅某些生物細胞(如微生物和腫瘤細胞)的合成代謝產(chǎn)物。一種抗生素只對一定種類的生物細胞有拮抗作用，這種作用范圍稱抗菌譜。
抗生素的抗菌機制，主要表現(xiàn)在影響細胞壁的合成，損傷或破壞細胞膜的結構，干擾細胞碳水化合物的代謝，抑制核酸或蛋白質(zhì)的合成，這些作用都有一定的選擇性。
（一)抗生素的抗菌試驗
1．試管稀釋法
【材料】
(1) 金黃色葡萄球菌肉浸液培養(yǎng)物(1∶1000)
(2) 100u/ml青霉素
【方法】
(1) 排列小管10支(表6-3)于第1管中加肉浸液1.8ml，其他各管各加1ml。
表6-3：抗生素抗菌試驗試管稀釋法(單位：ml)
試管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
肉浸液pH 7.0 1.8
1 1 1 1 1 1 1 1 1
青霉素100 u/ m藥品數(shù)據(jù)l 0.2 1 1 1 1 1 1 1 1 棄去1ml
青霉素濃度u /ml 10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125 0.156 0.078 0.03 對照
菌液(1:1000) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
結 果
注：以上各管均應嚴格按無菌操作進行
(2) 以100u/ml青霉素0.2ml加入第1管，用吸管反復吹勻后，吸1.0ml至第2管，再將第2管反復吹勻后，吸1.0ml至第3管。如此依次稀釋，至第9管時棄去1.0ml。第10管不加青霉素，作為對照。
(3) 每管各加葡萄球菌肉浸液培養(yǎng)物(1∶1000)0.1ml。
(4) 37℃孵育12～18h，觀察結果。
【結果判斷】：抗生素最高稀釋度仍能抑制細菌生長者，該管含藥濃度即為試驗菌株的敏感度(表6-4)。
表6-4：試管稀釋法細菌敏感度
＞2.0u /ml 耐 藥
2．紙片擴散法
紙片法檢驗程序(圖6-1)。
【材料】對青霉素敏感與耐藥的金黃色葡萄球菌液體培養(yǎng)物，對氯霉素敏感與耐藥的痢疾桿菌液體培養(yǎng)物，抗菌素濾紙片(青霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素等)，普通瓊脂平板，無菌鑷子，無菌棉簽。
【方法】
(1) 用無菌棉簽沾取培養(yǎng)6～8h的金黃色葡萄球菌及痢疾桿菌培養(yǎng)物，分別濃密地涂布于平板表面(注意棉簽不可過濕，涂布要均勻，致密)，待稍干。
(2) 將含有各種藥品的濾紙片按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域。
(3) 37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結果。量取各種抗菌素濾紙片周圍抑菌環(huán)大小，確定其對藥物的敏感情況(表6-5)。對比：(1)兩種細菌對各抗菌素敏感性差異；(2)同種不同株的細菌對同一種抗菌素敏感性的差異。
【結果】
觀察紙片周圍有無抑菌圈(圖6-2)，并量出抑菌圈直徑(包括紙片)大小，從表6-5得出金黃色葡萄球菌對所試抗生素的敏感性。
表6-5：幾種抗生素的抑菌圈與敏感標準
抗生素 低度敏感 中度敏感高度敏感
青霉素<10 10～15 >15
鏈霉素<10 10～15 >15
四環(huán)素<10 13～14 >14
慶大霉素 <12 13～14 >14
卡那霉素 <12
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圖6-1 紙片瓊脂擴散法試驗程序
(a)挑取菌落 (b)轉種肉湯 (c)比濁 (d)涂布平板上 (e)放置藥敏紙片 (f)量取抑菌圈大小
圖6-2 藥物敏感試驗(紙片法)示意圖 圖6-3 噬菌體的噬菌斑示意圖
（二)噬菌體的噬菌作用
噬菌體(bacteriophage)具有嚴格寄生性，對相應的易感細胞，具有高度的種特異性和型特異性。感染細胞后，可裂解宿主細胞，或處于溶原狀態(tài)。噬菌體可用于細菌的鑒定、分型、檢查未知細菌和防治某些疾病等。
【材料與方法】
1．噬菌體的溶菌現(xiàn)象
(1) 取4支肉湯管，2支接種金黃色葡萄球菌，2支接種大腸桿菌。
(2) 將上述種菌肉湯管各取1支，分別加入金黃色葡萄球菌噬菌體肉湯液0.2m1。
(3) 將上述4支肉湯管，置37℃培養(yǎng)6～12h觀察結果。
2．噬菌體的溶菌斑
(1) 取瓊脂平板1個，分為4等分，注明①、②、③、④。
(2) 分別用無菌棉簽在①、②處涂布接種痢疾桿菌，在③處涂布接種大腸桿菌，在④處涂布接種白色葡萄球菌。
(3)在②、③、④處中央各加1小滴痢疾桿菌噬菌體肉湯液(注意不要交叉污染)，在①處中央加1滴肉湯。
(4) 置37℃培養(yǎng)18～24h觀察結果。
【結果】
1．溶菌現(xiàn)象 加有噬菌體的金黃色葡萄球菌肉湯管清亮，其余均渾濁。
2．噬斑(圖6-3)，在②處的中央有一無菌生長的空斑，即噬斑，其余部位無此現(xiàn)象。
