儀器分析-電子教材:第五章分子熒光分析法

第五章  分子熒光分析法

第一節(jié) 概述

物質(zhì)分子吸收外界能量后，其電子能級由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子以輻射的形式釋放能量回到基態(tài)，根據(jù)這一現(xiàn)象建立的分析方法稱為發(fā)光分析法。外界提供能量的方式有多種，若物質(zhì)吸收光能后的激發(fā)態(tài)以電磁輻射形式釋放能量回到基態(tài)，稱為光致發(fā)光。常見的光致發(fā)光有熒光（fluorescence)和磷光（phosphorescence)兩種。根據(jù)研究對象的不同，熒光可分為原子熒光和分子熒光。根據(jù)物質(zhì)的分子吸收光能后發(fā)射出熒光光譜的特征和強度對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析方法稱為分子熒光分析法（molecularfluorescence analysis)。熒光的波長范圍比較廣，可從X光到紅外光區(qū)。本章重點介紹紫外、可見光區(qū)域的分子熒光。

熒光分析法不僅能直接測定熒光物質(zhì)，也能通過衍生反應(yīng)測定非熒光物質(zhì)。熒光分析法靈敏度高，其檢測限可達(dá)10^-10~10^-12g/ml，靈敏度比紫外可見光譜法高2～4個數(shù)量級，且選擇性好，能提供諸多分析信息。已成為重要的痕量分析手段，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。

 第二節(jié) 基本原理

一、分子熒光的發(fā)生過程

物質(zhì)分子中存在著電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。在室溫時，大多數(shù)分子處于電子基態(tài)的最低振動能級（基態(tài))。當(dāng)分子吸收能量（電能、光能、熱能或化學(xué)能等)后，就會發(fā)生能級之間的躍遷。可躍遷到激發(fā)態(tài)。分子在激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的，它很快躍遷回到基態(tài)。

在基態(tài)分子中，電子按能量最低原則成對地排列于一定的軌道中。根據(jù)泡利（Pauli)不相容原理，分子內(nèi)同一軌道中的兩個電子必須具有相反的旋轉(zhuǎn)方向，即自旋量子數(shù)S分別為1/2和-1/2，總自旋量子數(shù)（的代數(shù)和)S_總 =0，其分子態(tài)的多重性M=2S+1=1，該分子就處在單重態(tài)（見圖5—1a)。倘若分子吸收能量后在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的改變，則分子處于激發(fā)單重態(tài)（見圖5—1b)。如果在躍遷到高能級的過程中伴隨著電子自旋方向的改變，這時，分子便具有兩個不配對的電子，則有S_總=1，M=2S+1=3，該分子處在激發(fā)三重態(tài)（見圖5—1c)，用符號T表示。處在分立的電子軌道的非成對電子，平行自旋比配對自旋更穩(wěn)定，因此，三重激發(fā)態(tài)的能級比相應(yīng)的單重激發(fā)態(tài)的能級要低。

圖5-1  單重態(tài)和三重態(tài)

當(dāng)分子吸收光能量后，處于基態(tài)最低振動能級的分子躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)以至更高激發(fā)態(tài)的各個不同的振動能級(這一過程速度很快，大約10^-15s)，成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過輻射躍遷或無輻射躍遷釋放出能量返回基態(tài)，這一過程稱為去激發(fā)過程。

分子吸收光能量后去激發(fā)的光物理過程見圖5—2。

圖5-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖

圖中S₀，S₁，S₂分別表示分子的基態(tài)、第一和第二激發(fā)單重態(tài)，T₁表示第一激發(fā)三重態(tài)。激發(fā)態(tài)分子去激發(fā)過程中的幾種能量傳遞的方式有：①振動弛豫：激發(fā)態(tài)（如S₁和S₂)的分子通過與溶劑分子的碰撞，把多余的振動能量極迅速地（約為10^-12s)傳遞給周圍的分子，而自身返回該電子能級的最低振動能級。②內(nèi)部轉(zhuǎn)換：當(dāng)S₁的較低振動能級和S₂較高振動能級的能量相當(dāng)或重疊時，分子有可能從S₂的振動能級以無輻射方式過渡到S₁的振動能量相等的振動能級上，內(nèi)部轉(zhuǎn)換發(fā)生的時間為10^-12s。③熒光發(fā)射：處于第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的分子仍不穩(wěn)定，再以輻射形式發(fā)射光量子而返回基態(tài)的任意振動能級，這時發(fā)射的光量子稱為熒光。熒光發(fā)射過程約為10^-7~10^-9s左右。由于振動馳豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換使激發(fā)態(tài)分子失去部分能量，因此熒光的波長總比激發(fā)光波長要長。④外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子間相互作用，并以熱的形式損失部分能量的過程稱為外部轉(zhuǎn)換。外部轉(zhuǎn)換使熒光強度減弱或消失，導(dǎo)致熒光猝滅。⑤體系間跨越：在激發(fā)和去激發(fā)過程中，通常電子的旋轉(zhuǎn)狀態(tài)保持不變，但在某些狀態(tài)下，單重態(tài)通過體系間跨越，激發(fā)態(tài)電子改變其自旋方向出現(xiàn)三重態(tài)。當(dāng)兩種能態(tài)的振動能級重疊時，這種躍遷的概率增大。⑥磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)分子經(jīng)體系間跨越到達(dá)激發(fā)三重態(tài)后，并經(jīng)過振動馳豫到達(dá)三重態(tài)的最低振動能級，再回到基態(tài)各個振動能級的過程中發(fā)射出磷光。磷光發(fā)射涉及到電子自旋狀態(tài)的改變，屬于“禁阻躍遷”，其壽命比熒光要長，約為10^-3~10 s，所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，常常還可以觀察到后發(fā)光現(xiàn)象，而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。

二、激發(fā)光譜和熒光光譜

所有熒光化合物，都具有兩種特征光譜，即熒光激發(fā)光譜與熒光發(fā)射光譜。

(一) 熒光激發(fā)光譜 熒光激發(fā)光譜（excitation spectrum)簡稱激發(fā)光譜。固定熒光波長，改變激發(fā)光波長，測定不同波長的激發(fā)光激發(fā)所得到的熒光強度，然后以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強度F為縱坐標(biāo)作圖，即為該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜(如圖5-3虛線部分)。激發(fā)光譜相當(dāng)于熒光物質(zhì)的吸收光譜，此光譜上熒光強度最大所對應(yīng)的波長，就是激發(fā)熒光最靈敏的波長。

（二)熒光發(fā)射光譜  熒光發(fā)射光譜  (fluorescencespectrum)簡稱熒光光譜。固定激發(fā)波長在物質(zhì)的激發(fā)熒光最靈敏的波長，測定不同熒光波長時的熒光強度F，以熒光波長為橫坐標(biāo)，熒光強度F為縱坐標(biāo)作圖，即為熒光發(fā)射光譜， (如圖5-3實線部分)。此光譜上熒光強度最大的波長稱為最大熒光波長。

圖5-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜(環(huán)己烷作溶劑)

（三)三維熒光光譜 三維熒光光譜(Three dimensionalfluorescent spectroscopy )， 也稱總發(fā)光光譜、等高線光譜等。三維熒光光譜是20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的一種新的熒光分析技術(shù)，主要是能獲得激發(fā)波長與發(fā)射波長同時變化的熒光強度光譜圖。三維熒光光譜可用兩種形式表示： （1)三維曲線光譜圖；（2)平面顯示的等強度線光譜圖, 如圖5-4(a)和(b)所示。三維熒光光譜技術(shù)能夠獲得完整的熒光光譜的信息，是一種很有價值的光譜指紋技術(shù)�？梢赃M(jìn)行多組分混合物的定性、定量分析。

圖5-4 三維熒光光譜圖

（四)熒光光譜的特征

1．熒光光譜與激發(fā)光波長無關(guān)：從熒光發(fā)生過程可知，處于不同激發(fā)態(tài)分子的熒光發(fā)射，電子最終都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級開始，直接發(fā)射熒光而回到基態(tài)的各個振動能級上，所以熒光光譜與激發(fā)光波長無關(guān)。

2．熒光波長比激發(fā)光波長較長  這是由于激發(fā)光以無輻射躍遷失掉一部分能量到達(dá)第一電子激發(fā)態(tài)最低振動能級，再發(fā)射熒光，因此熒光發(fā)射能量比激發(fā)能量低，故熒光波長比激發(fā)光譜的波長較長。這種現(xiàn)象稱為Stokes位移，又稱紅移。

3．激發(fā)光譜與熒光光譜呈現(xiàn)鏡像對稱關(guān)系  以蒽乙醇溶液為例，激發(fā)光譜中的小峰是蒽分子吸收能量后從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的各個不同的振動能級所造成的。而發(fā)射光譜中的小峰是由于蒽分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級躍遷到基態(tài)的各個不同振動能級，發(fā)射不同的光量子所產(chǎn)生。大多數(shù)分子的基態(tài)振動能級分布和第一電子激發(fā)態(tài)振動能級分布相似，因此，激發(fā)光譜中躍遷能量最小的和最大的波長分別和熒光光譜中發(fā)射能量最大的和最小的相對應(yīng)，使激發(fā)光譜與熒光光譜相對稱并呈現(xiàn)鏡像關(guān)系。

（五)激發(fā)光譜與熒光光譜的應(yīng)用

1．定性分析  將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜圖的形狀、位置與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖進(jìn)行比較，即可進(jìn)行定性分析。由于有激發(fā)和發(fā)射兩個譜圖可供參考，所以熒光光譜法定性的可靠性較紫外可見吸收光譜法高。

2．定量分析 根據(jù)熒光光譜圖中最大激發(fā)波長λ_ex和最大熒光波長λ_em，可以得到定量分析的最佳光譜條件

三、熒光與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

熒光的發(fā)生涉及分子吸收輻射和激發(fā)態(tài)分子發(fā)射輻射兩個過程，因此，能夠發(fā)熒光的物質(zhì)必須同時具備兩個條件，一是物質(zhì)分子必須具有強的吸收紫外-可兄輻射的征結(jié)構(gòu)；二是必須具有較高的的熒光效率。

（一)熒光發(fā)射的量子產(chǎn)率

物質(zhì)發(fā)射熒光的光子數(shù)和所吸收的激發(fā)光光子數(shù)的比值稱為熒光量子產(chǎn)率(fluorescence quantumyield)，或稱熒光效率 (fluorescence efficiency)，用  表示：

可見的極大值為1，但事實上大部分熒光物質(zhì)的值均小于1并在1和0之間。許多能吸收光能量的物質(zhì)不一定會發(fā)出熒光，因為在激發(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能過程中除熒光發(fā)射外，有無輻射躍遷過程與之競爭。因此，熒光效率與熒光發(fā)射過程的速率及無輻射過程的速率有關(guān)，即：

  （5-1)

式中，為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)；無輻射躍遷過程的速率常數(shù)總和。主要取決于分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而與熒光物質(zhì)分子所處的化學(xué)環(huán)境有關(guān)，降低有利于體系的熒光增強。

（二)分子結(jié)構(gòu)與熒光

由于熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊性所致，在已知的大量有機物和無機物中，只有小部分可以產(chǎn)生熒光。熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)應(yīng)具備如下特征：

1．共軛π鍵結(jié)構(gòu) 絕大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)。因為這些分子具有共軛p鍵結(jié)構(gòu)，易發(fā)生π—π^*躍遷，分子體系共軛程度愈大，熒光效率愈高（表5-1)。另外含有共軛雙鍵的脂肪烴也可產(chǎn)生熒光，如維生素A，但這類化合物很少。

表5-1  三個化合物的共軛結(jié)構(gòu)與熒光效率的關(guān)系

2．剛性平面結(jié)構(gòu)  具有剛性平面構(gòu)型的分子有利于熒光發(fā)射， 由于這種剛性平面構(gòu)型降低了分子的振動，減少了分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用，提高了分子的熒光效率。例如熒光素呈平面構(gòu)型，是強熒光物質(zhì)，它在0.1mol/L NaOH溶液中的熒光效率為0.92，而與其結(jié)構(gòu)相似的酚酞由于沒有氧橋，分子不易保持平面，所以分子不發(fā)光，不是熒光物質(zhì)。

3. 取代基團(tuán)對分子熒光的影響  在芳香族化合物的芳香環(huán)上取代基不同，對熒光物質(zhì)的熒光光譜和熒光強度都有很大影響。給電子取代基，如：-NH₂、-OH、-OCH₃、-CN等，能增加分子的π電子共軛程度，使熒光效率提高；而吸電子基團(tuán)，如：-COOH、-NO₂、-C＝O、-F、-C1等，可減弱分子π電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。

四、熒光強度與溶液濃度的關(guān)系

分子熒光分析法是測定物質(zhì)吸收一定光能被激發(fā)之后，物質(zhì)本身所發(fā)射的熒光強度（F)。因此，被測溶液的熒光強度與該溶液吸收光能的強度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。當(dāng)強度為I₀的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)溶液后，可以從溶液的各個方向觀察到熒光，但激發(fā)光的一部分可透過溶液，為了消除透射光的影響，一般是在與激發(fā)光源垂直的方向觀測。如圖5-5所示

圖5-5  溶液的熒光

假設(shè)強度為I₀的入射光，照射到濃度為c，液層厚度為b的熒光物質(zhì)溶液上，透射光強度為I，被溶液吸收光強度為I₀ -I，溶液的熒光效率為，熒光強度為F。根據(jù)光吸收定律

  （5-2)

則     

（5-3)

由于溶液的熒光強度F與被溶液吸收的光強度及熒光效率成正比

則      

 （5-4)

式中k為比例常數(shù)

因  

  （5-5)

則 

    （5-6)

如果濃度c很小，當(dāng)時，中括號內(nèi)第二項以后的數(shù)值可以忽略不計，上式可寫成

（5-7)

對一定的熒光物質(zhì)，當(dāng)測定條件固定時，則

   （5-8)

對某一物質(zhì)的稀溶液()，在一定的條件下，物質(zhì)發(fā)出的熒光強度與該溶液的濃度成正比。即為分子熒光分析法的定量依據(jù)。

五、影響熒光強度的外部因素

（一) 溶劑的影響  

在不同的溶劑中，同一種熒光物質(zhì)，其熒光光譜的位置和熒光強度都有一定差異。溶劑的影響主要與溶劑的極性、粘度、純度有關(guān)。

1．熒光強度在一定范圍內(nèi)可隨溶劑粘度的減小而減小。因為溶劑粘度減小時增加了分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加，造成能量損失，熒光強度減弱。

2．溶劑和熒光物質(zhì)形成化合物，溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)改變，使熒光峰的波長和熒光強度發(fā)生變化。如在萘胺的乙醇溶液中加入鹽酸，隨著溶液中鹽酸濃度的增加，萘胺的—NH₂基逐漸被—NH₃Cl基所代替，而—NH₃Cl基對萘環(huán)的特征頻率的影響小于—NH₂，因此溶液的熒光光譜趨近于萘的熒光光譜。

3．熒光波長隨溶劑極性增大而紅移。許多共軛芳香族化合物激發(fā)時產(chǎn)生π—π^*躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑極性的增大，激發(fā)態(tài)能量的降低程度比基態(tài)大，結(jié)果使熒光光譜隨溶劑的極性增大而向長波方向移動。

4．溶劑的純度要高。雜質(zhì)會使被測物的熒光增強或減弱，甚至改變熒光光譜的形狀，最終干擾樣品的測定。如用乙醇作溶劑時，若含有微量蒽，會使溶劑本身產(chǎn)生熒光。特別是當(dāng)溶劑中存在降低熒光強度的物質(zhì)時，常常因不易被發(fā)覺而引入測定誤差。因此在使用前應(yīng)設(shè)法純化溶劑，消除干擾。

(二) 溫度的影響

溶液的熒光強度對溫度十分敏感，一般情況下隨著溫度的升高，熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強度減小。其主要原因是溫度升高時，介質(zhì)粘度減小，分子運動加快，分子間碰撞幾率增加，增加了分子的無輻射躍遷，降低了熒光效率。另外，有些熒光物質(zhì)在較高溫度下會發(fā)生光分解，導(dǎo)致熒光效率降低。降低溫度有利于提高熒光效率，因此，低溫?zé)晒夥治黾夹g(shù)已成為熒光分析的一個重要手段。

(三) 酸度的影響

酸度對熒光強度的影響主要表現(xiàn)在下列兩個方面：

1．影響熒光物質(zhì)的存在形式 熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，在不同酸度條件下分子和離子間的平衡發(fā)生改變，造成存在形式不同，而不同的結(jié)構(gòu)型體具有其特定的熒光光譜和熒光效率。例如苯胺，分子和離子間的平衡如下

苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，—NH₂為提高熒光效率的取代基，此時苯胺可產(chǎn)生藍(lán)色熒光，而pH＜2 和pH＞13的溶液中苯胺為離子形式，無熒光產(chǎn)生。

2．影響熒光配合物的組成 當(dāng)利用金屬離子與有機試劑生成熒光配合物進(jìn)行測定時，其配合物的穩(wěn)定性和組成受溶液pH值的影響較大，例如Ga²⁺與2，2-二羥基偶氮苯在pH為3~4的溶液中形成1：1配合物，產(chǎn)生熒光。而在pH6～7的溶液中則形成1：2的配合物，不產(chǎn)生熒光。

可見，熒光物質(zhì)的熒光光譜、熒光效率及熒光強度隨溶液pH值的變化而變化，為提高實驗結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度，在實驗時要嚴(yán)格控制溶液的pH值。

(四) 熒光猝滅

熒光物質(zhì)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強度下降，或熒光強度與溶液濃度不成線性關(guān)系的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑。常見的熄滅劑有：鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。引起熒光猝滅的原因有：

1．碰撞猝滅  激發(fā)態(tài)熒光物質(zhì)和猝滅劑分子碰撞使能量發(fā)生轉(zhuǎn)移。熒光分子以無輻射躍遷的方式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅作用。

2．靜態(tài)猝滅  熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子作用生成了不發(fā)光的配合物。

3．轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅  熒光物質(zhì)分子中引入溴、碘或氧后，易發(fā)生體系間跨越，醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)由單重態(tài)躍遷到三重態(tài)，而無熒光發(fā)射，引起猝滅。

4．熒光物質(zhì)的自猝滅  當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較高時由于熒光分子間碰撞幾率增加，以及分子間相互作用形成二聚體或多聚體，產(chǎn)生熒光自猝滅現(xiàn)象。溶液濃度越高，自猝滅現(xiàn)象越嚴(yán)重。

5．內(nèi)濾作用  當(dāng)溶液中存在能吸收熒光物質(zhì)的激發(fā)光或發(fā)射光的物質(zhì)時，也會使體系的熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)濾作用。如果熒光物質(zhì)的熒光光譜與該物質(zhì)的吸收光譜有重疊，當(dāng)濃度較大時，部分基態(tài)分子將吸收體系發(fā)射的熒光，從而使熒光強度降低，這種自吸現(xiàn)象也是一種內(nèi)濾作用。

熒光猝滅影響熒光測定，這是熒光分析中的不利因素，但是如果一個熒光物質(zhì)在加入某種猝滅劑后，熒光強度減小的程度和熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，如利用氧分子對硼酸根－二苯乙醇酮配合物的熒光猝滅效應(yīng)可以進(jìn)行微量氧的測定。鋁—桑色素配合物的熒光強度因微量氟離子的存在而引起熒光猝滅，可用于測定樣品中氟離子的含量。利用這一性質(zhì)建立猝滅劑的熒光測定法，稱為熒光猝滅法(fluorescencequenching method)。熒光猝滅法比直接熒光法更靈敏、更有選擇性。

(五) 散射光

在熒光分析中，干擾熒光測定的散射光主要有三種。

1．瑞利(Reyleigh)散射  物質(zhì)分子吸收光能后，不足以引起電子能級的躍遷，而是將分子激發(fā)到基態(tài)中較高的振動能級，并在極短的時間內(nèi)回到原來能級，所發(fā)射的光稱為瑞利散射光。由于它沒有能量損失，所以瑞利散射光和激發(fā)光的波長相同，且它的強度與波長的四次方成反比，即波長越短，瑞利散射越大。瑞利散射主要是由溶劑和其它共存物質(zhì)分子產(chǎn)生。

2．拉曼(Raman)散射  由于物質(zhì)分子吸收了光能后，被激發(fā)到基態(tài)的較高振動能級以后，返回到稍高于或稍低于原來的能級而發(fā)出的光稱拉曼散射光。其波長比它的激發(fā)光波長稍長或稍短。拉曼散射光較弱，且它的波長隨激發(fā)光的波長不同而改變。

3．丁鐸爾(Tyndall)散射  樣品池中如有膠體顆�；驓馀荽嬖跁r，入射光就會改變方向而進(jìn)入檢測器，這種現(xiàn)象稱為丁鐸爾散射。它的波長和激發(fā)光的波長一致，因此容易辨認(rèn)，當(dāng)樣品溶液除去膠粒和氣泡后，丁鐸爾散射即可消除。

散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，對熒光的測定干擾更大，必須采取措施消除。

瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，只要選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL即可將其消除。拉曼散射光波長與激發(fā)光波長有差值，并且隨激發(fā)光波長改變而改變，而熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān)，即可通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長把物質(zhì)的熒光與溶劑拉曼散射光區(qū)別開來。有時溶劑的拉曼光譜與物質(zhì)的熒光光譜相重疊影響熒光測量，故激發(fā)光的選擇一方面要考慮較高的靈敏度，另一方面要使溶劑的拉曼散射光與熒光峰相距遠(yuǎn)些，以避免干擾。

表5—2為水、乙醇、環(huán)己烷等常用溶劑在不同波長激發(fā)光照射下拉曼光的波長�？晒┻x擇激發(fā)光波長或溶劑時參考。

表5-2  在不同波長激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長（nm)

第三節(jié) 熒光分析儀器

一、儀器的主要部件

測量熒光強度的儀器有熒光光度計和熒光分光光度計。前者結(jié)構(gòu)簡單，價格便宜；后者構(gòu)造精細(xì)，不僅定量測定的靈敏度和選擇性高，還可用于熒光物質(zhì)的定性鑒定。盡管儀器的類型不同，但其基本部件均包括下列五個部分：①激發(fā)光源；②單色器；③樣品池；④檢測器；⑤放大指示器。圖5-7是熒光計示意圖。

圖5-6 熒光計的示意圖

由光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分光后，照射到樣品溶液上，在波長λ_ex的紫外可見光激發(fā)下，樣品發(fā)出熒光。為了防止激發(fā)光的干擾，在與激發(fā)光垂直的位置上檢測樣品的熒光。樣品發(fā)出的熒光通過發(fā)射單色器分光后照到檢測器上，檢測器得到相應(yīng)于各種熒光波長λ_em時的熒光強度F。

1．激發(fā)光源  理想的光源應(yīng)能發(fā)射含有各種波長的紫外光和可見光，光的強度不僅足夠大，并且在整個波段范圍內(nèi)強度一致，但是理想的光源不易得到，通常用高壓汞燈、鹵鎢燈和氙燈。高壓汞燈產(chǎn)生強烈的線光譜。濾光片熒光光度計的光源大都用汞燈或鹵鎢燈(碘鎢燈或溴鎢燈300nm～700nm)作光源。

高壓氙燈是一種短弧氣體放電燈，是熒光分光光度計應(yīng)用最廣的光源。燈內(nèi)裝有氙氣，通電后氙氣電離，同時產(chǎn)生較強的連續(xù)光譜，波長在250nm～700nm之間，而且在整個波段內(nèi)，發(fā)光強度幾乎相等。由于氙燈的啟動電壓約20kV－40kV，所以當(dāng)儀器配有計算機時，應(yīng)使氙燈點著穩(wěn)定后再開計算機．

以激光為光源的熒光分析法，可極大地提高熒光分析的靈敏度，目前激光誘導(dǎo)熒光光譜分析已達(dá)到單個分子檢測水平。

2．單色器  測定熒光的儀器需有兩個單色器，第一單色器在光源與樣品池之間，稱激發(fā)單色器，其作用是讓所選擇的激發(fā)光透過照射在被測物質(zhì)上。第二單色器在樣品池和檢測器之間，與激發(fā)光源成90度角，稱為熒光單色器，它可以把容器的反射光、溶劑的散射光以及溶液中雜質(zhì)所產(chǎn)生的熒光除去，只讓特征波長的熒光通過而照射于檢測器上。

熒光光度計采用濾光片作單色器，分光能力較差，不能進(jìn)行激發(fā)光譜與熒光光譜的掃描。濾光片有三種: ①截止濾光片，用于截止雜散光或不需要波長的光，為發(fā)射單色器；②帶通濾光片，實際上有兩個截止濾色片組成,允許通過某一波長的光并有一定的譜帶寬度,透光率比截止濾色片差, 為激發(fā)單色器；③干涉濾光片，由兩個玻璃板之間附著兩層或多層金屬膜制成。每一層膜用一個無吸收物質(zhì)作隔膜與下一層金屬膜分開。金屬膜之間的距離決定了透過光的波長。使用干涉濾色片能得到較窄的帶寬和較高的透過率。

熒光分光光度計用光柵作單色器，光柵的分光能力強，且色散是線性的，便于進(jìn)行光譜掃描。但是色散后的光線有級數(shù)，須加前置濾光片加以消除。

3．樣品池  熒光測定用的樣品池一般用石英制成，因為玻璃會吸收320nm以下的紫外光。樣品池的形狀以散射光較少的方形為宜。低溫?zé)晒鉁y定時可在石英池外套上一個盛放液氮的石英真空瓶，來降低溫度。

4．檢測器  用紫外可見光為激發(fā)光源時產(chǎn)生的熒光多為可見熒光，強度較弱，因此要求檢測器的靈敏度較高，通常采用光電倍增管。目前，光電二極管陣列式檢測器也已用于熒光分光光度計。

5．放大指示器  電信號經(jīng)放大器放大后可由表頭指示或數(shù)字顯示熒光強度，由記錄儀記錄結(jié)果。

二、儀器的類型

熒光儀器主要有熒光光度計和熒光分光光度計兩類。

（一)熒光光度計  用溴鎢燈或汞燈作光源，單色器為濾光片，通過第一濾光片可獲得一定通帶寬度的激發(fā)單色光，通過第二濾光片可得到所需要波長范圍的熒光。該類儀器一般用光電管為檢測器，電信號經(jīng)放大后用微安表指示出來。結(jié)構(gòu)簡單，價格較便宜，但只適用于物質(zhì)的定量分析。

另一種比較高級的熒光光度計是第一單色器用濾光片，第二單色器用棱鏡分光，這樣的儀器雖然不能得到激發(fā)光譜，但可得到熒光發(fā)射光譜，而且定量分析的靈敏度、選擇性得到提高。

（二)熒光分光光度計  熒光分光光度計采用氙燈作光源，通過狹縫經(jīng)光柵分光后照射到被測物質(zhì)上，發(fā)射的熒光經(jīng)第二單色器分后，用光電倍增管檢測熒光強度，經(jīng)放大器放大后由記錄儀記錄結(jié)果。它不僅定量分析的靈敏度高和選擇性好，而且可以掃描繪出物質(zhì)的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，進(jìn)行定性分析。

第四節(jié) 熒光分析方法和應(yīng)用

—、定性分析

熒光物質(zhì)的特征光譜有激發(fā)光譜和熒光光譜兩種，而紫外可見分光光度法中，只能得到被測物質(zhì)的一種特征吸收光譜，因此，用熒光分析法做物質(zhì)鑒定時可靠性更強。定性方法是將其特征光譜的形狀、波長范圍與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，從而確定待測物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否為同一物質(zhì)。

例如，大氣煙塵中苯并(a)芘的測定。樣品分離純化后，在熒光分光光度計上固定激發(fā)波長在386nm，第二單色器掃描，獲得樣品的熒光光譜。然后固定熒光波長在407nm，第一單單色器掃描，獲得樣品的激發(fā)光譜。如果確系苯并(a)芘，則測得的熒光光譜、激發(fā)光譜應(yīng)和苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品的光譜完全一致。

二、定量分析

熒光分析法更多用于熒光物質(zhì)的定量分析，根據(jù)熒光強度與該溶液的濃度成正比的定量關(guān)系，在一定的濃度的范圍內(nèi)，可以采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和直接比較法進(jìn)行定量。

（一)標(biāo)準(zhǔn)曲線法

取已知量的標(biāo)準(zhǔn)被測物質(zhì)，用與樣品相同的方法處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次測量其熒光強度。以熒光強度對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測出樣品溶液的熒光強度，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品中熒光物質(zhì)的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線在應(yīng)用過程中要不斷進(jìn)行校正。如果該溶液在紫外光照射下不夠穩(wěn)定，則需改用另一種穩(wěn)定而且熒光峰相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行校正。例如測定維生素B₁時，用硫酸奎寧為基準(zhǔn)；測定維生素B₂時，用熒光素鈉作為基準(zhǔn)。

（二)直接比較法

要求待測物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度必須在線性范圍之內(nèi)。測定時，配制一已知濃度的被測物標(biāo)準(zhǔn)溶液，與樣品用相同方法處理后，測定得標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的熒光強度分別F_s和F_x，求得樣品中熒光物質(zhì)含量。若空白溶液的熒光強度為F₀，則

（5-9)

  （5-10)

在同一條件下k為常數(shù)，則有

   （5-11)

三、熒光分析法的應(yīng)用

熒光分析可以利用直接熒光分析和間接熒光分析測定許多類有機化合物和無機物。對于自身能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)可用直接熒光法測定。對于許多不發(fā)熒光或熒光效率很小的有機物和無機物，則通過化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變成熒光物質(zhì)后進(jìn)行間接測定。因此，熒光分析廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生檢驗、臨床檢驗、生物化學(xué)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。

（一)有機化合物的熒光分析

芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的有機化合物在紫外光照射下大多數(shù)能發(fā)熒光。多環(huán)芳烴普遍存在于大氣、水、土壤、動植物及加工食品中，目前已知有200多種具致癌性的多環(huán)芳烴，苯并(a)芘是致癌活性最強的一種，通過萃取或色譜分離后

進(jìn)行熒光測定，方法可靠，測定最低濃度可達(dá)0.1mg/L。

食品中維生素含量的測定是食品分析的常規(guī)項目。幾乎所有種類的維生素都可以用熒光法進(jìn)行分析。氨基酸、蛋白質(zhì)的熒光分析也都是很靈敏的常用方法。

對于某些弱熒光性物質(zhì)甚至不發(fā)熒光的物質(zhì)，如甾族化合物，經(jīng)濃H₂SO₄處理后，可使不產(chǎn)生熒光的環(huán)狀醇類結(jié)構(gòu)，改變?yōu)楫a(chǎn)生熒光的酚類結(jié)構(gòu)。幾種用于有機化合物的熒光試劑見表5-3。

表5-3  用于有機化合物測定的熒光試劑

(二) 無機元素的熒光分析

能產(chǎn)生熒光的無機物僅有鈾鹽等少數(shù)幾種，但許多金屬或非金屬離子可以和有機化合物形成熒光配合物,從而進(jìn)行熒光分析。目前利用該法可進(jìn)行熒光分析的無機元素已近70種。常見的幾種熒光測定試劑見表5-4。

表5-4 幾種熒光測定試劑

（三)基因研究及其檢驗

遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA)，自身的熒光效率很低，一般條件下幾乎檢測不到DNA的熒光。因此，通常選用某些熒光分子作為探針，通過探針標(biāo)記分子的熒光變化來研究DNA與小分子及藥物的作用機理，從而探討致病原因及篩選和設(shè)計新的高效低毒藥物。目前，典型的熒光分子探針為溴乙啶（ED)。此外也使用Tb³⁺、吖啶類染料、鈣的配合物等。在基因檢測方面，已逐步使用熒光染料作為標(biāo)記物，來代替同位素標(biāo)記，從而克服了同位素標(biāo)記帶來的污染、價格昂貴及難保存等不足。

（四)時間分辨熒光免疫分析

近年來，時間分辨熒光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)作為一種新型的非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)，其應(yīng)用不再局限于臨床診斷，現(xiàn)已滲透入生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

在通常的熒光測定中，主要討論熒光強度和熒光波長的熒光光譜圖的信息應(yīng)用，由于測試樣品中含有多種熒光成分，背景干擾強，因此成了熒光分析法大范圍推廣使用的瓶頸。然而熒光在發(fā)射過程中還有壽命信息，TRFIA巧妙地利用了熒光強度和時間的變化的關(guān)系及熒光壽命差別的信息，除了能測定熒光物質(zhì)的熒光壽命外，還可以消除干擾物和背景熒光的干擾，以及熒光混合物中多組分含量分析。當(dāng)混合物中多組分的熒光壽命差超過4ns時，便可進(jìn)行多組分同時測定。

TRFIA具有靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染、多標(biāo)記等優(yōu)點�，F(xiàn)已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發(fā)展前景的分析手段。

第五節(jié) 磷光分析法簡介

分子磷光分析法與分子熒光分析在原理、儀器和應(yīng)用等方面非常相似，與熒光相比，磷光具有如下三個特點：①磷光輻射的波長比熒光長，這是因為分子的T_l態(tài)能量比S₁態(tài)低；②磷光的壽命比熒光長。由于熒光是S₁—S₀輻射躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷是自旋許可的躍遷，因而S₁態(tài)的輻射壽命通常在10^-7～10^-9s；磷光是T₁—S₀躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷屬自旋禁阻的躍遷，其速率常數(shù)要小得多，因而輻射壽命要長，大約為10^-4～10s；③磷光的壽命和輻射強度受重原子和順磁性離子存在的影響極其敏感，使磷光增強，熒光則相反。

一、低溫磷光

由于激發(fā)三重態(tài)的壽命長，這使三重態(tài)去激發(fā)過程中的無輻射躍遷，如分子內(nèi)部轉(zhuǎn)化、激發(fā)態(tài)分子與周圍的溶劑分子間發(fā)生碰撞和而能量轉(zhuǎn)移以及發(fā)生某些光化學(xué)反應(yīng)等的概率增大，使磷光強度減弱，甚至完全消失。為減少這些去激發(fā)過程的影響，通常應(yīng)在低溫下測量磷光，以減少無幅射躍遷對磷光發(fā)射的影響。

低溫磷光分析中，液氮是最常用的冷卻劑。因此要求所使用的溶劑，在液氮溫度(77K)下對所分析的試樣應(yīng)具有良好的溶解特性，本身又容易制備和提純，并在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)沒有很強的吸收和發(fā)射。最常用的溶劑是EPA，它由乙醇、異戊烷和二乙醚按體積比為2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶劑IEPA(由EPA：碘甲烷＝10：1組成)，有利于系間跨越躍遷，可以增加磷光效應(yīng)。

二、室溫磷光

由于低溫磷光需要低溫實驗裝置，并且溶劑選擇以及應(yīng)用范圍受到一定的限制。所以目前發(fā)展了多種室溫磷光法(RTP)。有固體基質(zhì)室溫磷光法(SS-RTP) ；膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法(MS-RTP) 執(zhí)業(yè)護(hù)士網(wǎng)；敏化溶液室溫磷光法(SS—RTP)。

膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法(MS-RTP)當(dāng)溶液中表面活性劑的濃度達(dá)到臨界膠束濃度后，便相互聚集形成膠束。由于這種膠束的多相性，改變了磷光團(tuán)的微環(huán)境和定向的約束力，從而強烈影響了磷光團(tuán)的物理性質(zhì)，減小了內(nèi)轉(zhuǎn)化和碰撞能量損失等非輻射去激發(fā)過程的趨勢，明顯增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，從而可以實現(xiàn)在溶液中測量室溫磷光。利用膠束穩(wěn)定的因素、結(jié)合重原子效應(yīng)和溶液除氧，是MS-RTP的三個要素。

三、磷光分析法應(yīng)用

磷光分析在無機化合物測定中應(yīng)用較少，主要用于藥物分析、環(huán)境分析等等領(lǐng)域的有機樣品。一些有機化合物的磷光分析見表5—5。

表5-5  一些有機化合物的磷光分析^*

*WM 為水甲醇溶液；DL為檢出限（g/ml)

  (李珊，康維鈞)