油酸型呼吸窘迫綜合征的發(fā)生與治療 【實驗?zāi)康摹? 復(fù)制油酸型呼吸窘迫綜合征（respiratory distress syndrome ，RDS)動物模型，初步探討其發(fā)病機制。觀察藥物對油酸導(dǎo)致的急性肺損傷的防護作用。學(xué)習(xí)肺順應(yīng)性（pulmonary compliance)、肺系數(shù)、肺泡灌洗液表面張力等指標測定方法。 【實驗原理】 化學(xué)性因素油酸所致急性肺損傷主要是通過激活補體，產(chǎn)生趨化因子使中性粒細胞與巨噬細胞在肺內(nèi)聚集、激活，釋放大量氧自由基、蛋白酶和花生四烯酸代謝產(chǎn)物等炎性介質(zhì)，對肺泡-毛細血管膜的損傷，使之發(fā)生通透性增高等變化而引起以肺水腫為主要病變的RDS。后者能導(dǎo)致通氣/血流比值失調(diào)及肺泡-毛細血管膜的彌散障礙，發(fā)生換氣功能障礙而引起呼吸衰竭。 肺順應(yīng)性是指肺在外力下的可擴張性，與肺彈性阻力成反比。肺順應(yīng)性可用單位跨肺壓引起的肺容積變化來表示。RDS時，由于肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡表面活性物質(zhì)減少等因素導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降，進而影響肺通氣功能。 三莨菪堿（654-2)、二甲基亞砜（DMSO)、維生素C（VitC)、維生素E（VitE)等均為有效的抗氧化劑，可對抗炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的過氧化損傷。在靜脈注射油酸前，先給予上述藥物，觀察其對RDS時肺損傷的防護作用。 【實驗器材和藥品】 充氣檢壓裝置、顯微鏡、血細胞計數(shù)器、哺乳類動物手術(shù)器材1套、兔手術(shù)臺、生理鹽水、氣管插管、注射器(100ml、10ml各1支)、20ml量杯、50ml燒杯2個、0.05ml刻度吸管2個。酒精燈、25%烏拉坦、油酸、654-2，50 %DMSO、醫(yī)用液體石蠟。血氣分析儀。 【實驗動物】 家兔，體重約2.5kg。 【實驗方法和步驟】 一、實驗分組 取家兔3只稱重，分別固定于兔臺上，耳緣靜脈緩慢注射25%烏拉坦4ml/Kg麻醉。頸部手術(shù)作氣管插管、頸總動脈插管。觀察一般狀況和記錄呼吸頻率及深度。從頸總動脈采血，測定手術(shù)后血氣各項指標（血pH、Pco2、Po2)。隨機將家兔分為3組： 1. 油酸RDS動物模型組 耳緣靜脈注射油酸0.1ml/Kg，30分鐘后觀察并記錄呼吸的改變，再追加油酸0.1ml/Kg，每10分鐘觀察記錄呼吸變化，待呼吸等癥狀明顯時，采血，測定注射油酸后的血氣指標。 2. 實驗治療組 可選擇654-2或DMSO治療。用654-2治療：2mg 654-2溶于25ml生理鹽水中，耳緣靜脈注射（20min注完)，再注射油酸（劑量和程序同“油酸組”)。用DMSO治療：耳緣靜脈注射50 %DMSO 10ml/kg，20min后再注射油酸（劑量和程序同“油酸組”)。 3. 對照組 耳緣靜脈注射生理鹽水0.2ml/Kg，注射程序同 “油酸組”。 二、觀察項目 1．觀察各組家兔呼吸頻率及深度變化、血氣指標的變化。待油酸組出現(xiàn)明顯癥狀，如煩躁、呼吸急促、甚至仰頭呼吸，鼻腔噴出粉紅色泡沫等，立即取血測定外周血白細胞（WBC)。 2. 外周血WBC測定 用針頭刺破各組家兔耳緣靜脈，取血測定WBC，具體步驟參照附錄。計算計數(shù)盤四角大方格WBC總和（Y)，外周血WBC = Y ′ 50 ′ 106 /L。 3．家兔左肺順應(yīng)性的測定 （1)實驗裝置連接 如圖6-3，安裝充氣檢壓裝置，使水檢壓計一端側(cè)管與一玻璃三通管相連，一端經(jīng)橡皮管與氣管插管相連，另一端經(jīng)橡皮管與100ml注射器相連。在與注射器相連的皮管中間，再接一三通玻璃管，游離的一端接一短皮管。用止水夾控制其啟閉，以調(diào)節(jié)檢壓系統(tǒng)的壓力平衡。做充氣用的注射器內(nèi)涂少量石蠟油，以防漏氣。
圖6-3 充氣減壓裝置 （2)手術(shù) ① 用鐵錘猛擊各組家兔枕部使之猝死，仰臥位固定在兔臺上。用粗剪刀剪除頸部及胸部正中區(qū)域的毛，在頸部正中作4cm長的縱行切口，暴露氣管。 ② 用止血鉗分離氣管周圍組織，下面穿線備用。在氣管甲狀軟骨下1cm做一倒“T”切口，插入直型氣管插管并結(jié)扎固定。 ③ 然后沿胸骨右側(cè)剪開胸壁，再沿氣管分離出右主支氣管，用止血鉗夾閉右主支氣管及其肺門血管。 ④ 在左側(cè)胸壁選一肋間隙用止血鉗鈍性分離肋間肌，仔細穿破胸膜造成氣胸，使左肺萎陷（注意不要損傷肺臟)。 ⑤ 剪斷胸骨兩側(cè)的肋骨，除去胸骨，暴露肺臟。觀察各組肺的一般性狀。 （3)左肺的壓力-容積曲線測定 先把充氣檢壓裝置的注射器內(nèi)吸入50ml空氣，然后將膠管一端連于家兔之氣管插管上，此時注意檢壓計之液面是否在零位。如不在零位可打開注射器前端之T形管側(cè)管，調(diào)整水檢壓計使零點與肺同高，以平衡肺內(nèi)壓。以后緩慢推進注射器向肺內(nèi)充氣，至水檢壓計讀數(shù)達2cm處，間歇10s，記錄充氣量。若在間歇期檢壓計液面有少許下移，可繼續(xù)充以少量空氣，以保持原來壓力水平。以同樣的方法，依每次遞增2cm水柱的肺內(nèi)壓向肺內(nèi)充氣，直到整個肺完全擴張，同時記錄每次肺內(nèi)壓增加的肺內(nèi)充氣量。以充氣時的壓力變量為橫坐標，以充氣時的容積變量為縱坐標，繪制壓力-容積曲線。以同樣的原理立即制備抽氣時的壓力-容積曲線。對照組家兔可在左肺用生理鹽水灌洗后（見下)，再重復(fù)測定壓力-容積曲線，比較兩者的變化。 4. 左肺支氣管-肺泡灌洗、支氣管-肺泡灌洗液（broncho-alveolar-lavage fluid，BALF)WBC計數(shù)和蛋白的測定 (1) 將充氣檢壓裝置的橡皮管從氣管插管上取下，用10ml注射器抽取生理鹽水8ml，從氣管插管注入左肺內(nèi)，改變家兔體位，盡可能使生理鹽水沖洗到每一肺葉，然后將BALF回抽并倒入20ml量杯內(nèi)。重復(fù)以上述方法灌洗左肺2次，記錄灌洗液的回收量，備用。 (2) 按照本節(jié)附錄計算計數(shù)盤中四個大方格中WBC總和（Y)。BALF的WBC總數(shù)按下列公式算出：Y′50′回收液ml數(shù)′103。 (3) 用直接燒灼法定性測定BALF蛋白濃度：把各組家兔的BALF 3～4ml注入試管。在酒精燈上燒灼上方的液面，比較混濁的程度�；鞚岢潭仍礁弑硎疽后w的蛋白含量越高。 5. 灌洗液表面張力定性觀察 把灌洗液傾入50ml燒杯內(nèi)，再用另一50ml燒杯裝入生理鹽水，使其液面大致與灌洗液相仿。分別插入0.05（或0.1)ml之刻度吸管，讀出兩種液體在吸管內(nèi)的上升高度。液面上升高者表面張力大，反之表面張力小。 6. 肺系數(shù)測定 沿止血鉗上緣剪斷右主支氣管及肺門血管，取出右肺稱重計算肺系數(shù)（右肺重g′2/體重Kg)。 【實驗注意事項】 1. 制備一無損的氣管-肺標本，是實驗成敗的關(guān)鍵，手術(shù)過程要細心，特別要將肺與周圍脂肪組織相區(qū)別，因其顏色近似。 2. 實驗中要保持肺組織的濕潤。 【討論思考題】 1. 順應(yīng)性的概念，表達方法及與彈性阻力之間的關(guān)系是什么？順應(yīng)性大小與肺容積之間有無關(guān)系？ 2. 比較注氣、抽氣與作支氣管肺泡灌洗后再灌氣所得兩條壓力－容積曲線，可作出什么推論？ 3. 注入油酸后壓力-容積曲線有何變化？ 4. 耳緣靜脈注入油酸后，家兔有何癥狀出現(xiàn)？為什么？ 5. 根據(jù)血氣指標變化，分析家兔呼吸衰竭的類型和發(fā)病機制。 6. 根據(jù)實驗所得資料、數(shù)據(jù)，分析油酸型RDS可能的發(fā)病機制。 附錄：WBC計數(shù) 原理：將血液或BALF用WBC稀釋液（1%鹽酸、稀龍膽紫液)稀釋，使紅細胞破壞溶解，WBC稀釋液中的龍膽紫可使WBC的核染上顏色，使WBC形態(tài)更加清晰之后進行計數(shù)，求得血液內(nèi)WBC數(shù)/mm3。 步驟： 圖6-4 細胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)
1. 熟悉血細胞計數(shù)板構(gòu)造（見圖6-4) 2. 儀器洗滌 實驗前應(yīng)先將血細胞計數(shù)板洗滌干凈。吸血管中的血跡應(yīng)先用自來水洗去后，再用蒸餾水洗三遍，然后吸入95%酒精洗兩次，以除去管內(nèi)的水分。最后吸入乙醚1～2次，除去酒精。每次排除管內(nèi)的洗滌液時，可用手把橡皮管摺曲，擠壓數(shù)次便可驅(qū)盡。吸血管洗凈后應(yīng)毫無血跡和水珠，其中的玻璃小珠應(yīng)能自由轉(zhuǎn)動而不致粘在管壁上為合格。計數(shù)板在用自來水和蒸餾水相繼洗凈后，即用擦鏡紙試干，切不可用酒精或乙醚洗滌，以免損壞計數(shù)板上的刻度。 3. 在低倍鏡下觀察血細胞計數(shù)室（見圖6-5) 4. 準確將WBC稀釋液0.38ml加到小試管中。 5. 吸血 用WBC吸血管吸血到20 mm3，擦去尖外多余血。將血液加入到稀釋液中，混勻。 6. 將血液加入稀釋液中，混勻。 7. 充液 取蓋玻片平放在計數(shù)板上，手執(zhí)吸血管，吸取將要測定的液體，然后將吸血管口輕輕斜置于蓋玻片邊緣，滴出少量液體，此時液體由于毛細管作用而進入計數(shù)室內(nèi)。注意：如果計數(shù)室內(nèi)留有氣泡或液體過多以至溢出室外凹溝中，都應(yīng)該洗去重新充液。 8. 計數(shù) 充液后靜置3分鐘，在低倍顯微鏡下找到“井”形大方格，計數(shù)其四個大方格的白細胞。
圖6-5 改良牛鮑爾（Neubauer)氏血細胞計數(shù)室
計算計數(shù)盤中四角的四個大方格中WBC總和，再乘以50而得每立方毫米血液內(nèi)的白細胞總數(shù)。如四個大格WBC總和為Y，則： Y/4（變?yōu)槊科椒胶撩?′10（變?yōu)榱⒎胶撩?′20（稀釋倍數(shù))=Y′50（個/ mm3) 酸堿平衡紊亂 【實驗?zāi)康摹?/B> 1. 復(fù)制動物呼吸性酸中毒、代謝性酸中毒和代謝性堿中毒等三種類型的酸堿平衡紊亂模型。 2. 觀察三種類型酸堿平衡紊亂引起的機體機能和血氣指標的改變。 【實驗原理】 通過夾閉部分氣管插管模擬氣道阻塞，靜脈輸入乳酸和碳酸氫鈉等方法，造成家兔呼吸性酸中毒、代謝性酸中毒和代謝性堿中毒等三種類型的酸堿平衡紊亂模型。檢測各項機體功能指標的改變和進行動物血氣分析，觀察三種類型的酸堿平衡紊亂對機體的影響。 【實驗器材與藥品】 BL-420E生物機能記錄系統(tǒng)，血氣分析儀，家兔手術(shù)臺1套，哺乳動物手術(shù)器械1套，家兔氣管插管，動脈插管，動脈夾，50mL注射器2支，1mL注射器5支，頭皮針1支，直徑10mm橡皮塞5個。 3%戊巴比妥鈉，5%乳酸溶液，5%碳酸氫鈉溶液，1%肝素溶液。 【實驗對象】 家兔，雌雄不限 【實驗方法和步驟】 一.手術(shù)操作 1．抓取家兔稱重，3%戊巴比妥鈉1mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺上。 2．剪去頸部被毛， 在頸正中做4-5cm切口，分離氣管做氣管插管。連接BL-420E記錄系統(tǒng)，選擇輸入信號，經(jīng)第1通道：呼吸，描記呼吸曲線。分離左側(cè)頸總動脈，穿雙線備用。 3. 耳緣靜脈注入1％肝素1mL/kg進行全身抗凝，留置頭皮針待用。 4. 結(jié)扎頸總動脈遠心端，近心端用動脈夾夾閉。經(jīng)盡量靠近遠心端結(jié)扎處用眼科剪剪一“V”字形切口，向心方向插入動脈插管。連接BL-420E系統(tǒng), 經(jīng)第2通道，選擇輸入信號：壓力，描記血壓曲線。 5. 用1mL注射器吸取少量1％肝素，濕潤內(nèi)壁后排出多余肝素。通過動脈插管三通管采集動脈血1mL，隨后迅速把注射器針頭刺入橡皮塞，并使注射器在掌中來回滾動混勻，立即用血氣分析儀進行血氣指標的測定。隨后觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標并填入下表（表 6-2)。 6. 用止血鉗夾閉一側(cè)氣管插管的2/3，造成氣道阻塞。持續(xù)10min，觀測并記錄心率、呼吸幅度與頻率等指標。采用上述方法采集動脈血1mL，測定血氣指標。 7. 待動物呼吸恢復(fù)正常后，經(jīng)耳緣靜脈緩慢注入5％乳酸溶液15mL/kg，同時注意觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標。按上述方法取動脈血1mL，測定血氣指標。 8. 經(jīng)耳緣靜脈留置的頭皮針處，注入5％碳酸氫鈉8mL/kg。注射完畢，觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標。按上述方法取動脈血1mL，測定血氣指標。 9. 經(jīng)頭皮針處，注入5％碳酸氫鈉15mL/kg。注射完畢，觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標。按上述方法取動脈血1mL，測定血氣指標。 二．觀察指標 1.心率、血壓，呼吸幅度與頻率。 2. 血氣指標：pH，PCO2，PO2，SB，AB，BB，BE，[K+]，[Cl-]。 【實驗注意事項】 1. 用來檢測血氣的血液一定要于空氣隔絕，動作要快，否則會影響結(jié)果。 2. 乳酸對血管有一定的刺激作用，在注射過程中要防止動物掙扎。 3. 乳酸與碳酸氫鈉溶液的注入一定要緩慢，最好能維持在2mL/min。 【討論思考題】 1. 試比較三種類型的酸堿平衡紊亂在血氣方面的改變有什么不同，各有何特點？ 2. 三種類型的酸堿平衡紊亂對呼吸與心率、血壓各有什么影響？ 表 6-2 實驗結(jié)果記錄 類型 pH PCO2 PO2 SB AB BB BE 呼吸 心率 血壓 頻率 幅度 | 正常 呼吸性酸中毒 代謝性酸中毒 代謝性堿中毒 |
（陸麗) 實驗 6. 7 微循環(huán)觀察及失血性休克 【實驗?zāi)康摹?/B> 1. 觀察微循環(huán)以及在失血性休克的變化； 2. 復(fù)制失血性休克的動物模型，觀察休克發(fā)生發(fā)展過程中血壓和微循環(huán)血流等的變化，加深對于“休克發(fā)病的關(guān)鍵不在于血壓，而在于血流”的理論認識。 3. 設(shè)計搶救方案，加深對休克防治原則及所用藥物藥理作用的理解，培養(yǎng)獨立分析問題、解決問題的能力。 【實驗原理】 微循環(huán)是指微動脈至微靜脈之間的血液循環(huán)。典型的微循環(huán)由微動脈、后微動脈、毛細血管前括約肌、毛細血管網(wǎng)、直捷通路、動-靜脈吻合支和微靜脈等部分組成。按照微循環(huán)學(xué)說，休克發(fā)生的關(guān)鍵是微循環(huán)灌流障礙；根據(jù)病情進展，微循環(huán)變化可分為缺血性缺氧期、淤血性缺氧期和微循環(huán)衰竭期。 導(dǎo)致休克的原因有多種，其始動環(huán)節(jié)都是血容量急性降低、急性心泵功能障礙和血管容量迅速擴大。家兔的血容量可按體重（g)乘以8%來估算（ml)。急性出血，出血量在血容量的10%以下，機體通過代償機制可不表現(xiàn)癥狀；出血量達20~30%，動物發(fā)生休克；出血量達50%，動物死亡。 失血性休克的臨床表現(xiàn)是血壓明顯下降、皮膚蒼白、四肢冰冷、尿量減少、中心靜脈壓下降, 此外還有心率、呼吸增快等。 搶救休克的原則是去除病因、擴容、糾酸、合理使用血管活性物質(zhì)、使用藥物保護細胞以及防止器官衰竭。據(jù)此，同學(xué)們可自行設(shè)計搶救方案。 【實驗器材和藥品】 BL-420E生理科學(xué)實驗系統(tǒng)，兔手術(shù)臺，壓力換能器，呼吸流量換能器，BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，恒溫灌流盒，哺乳動物手術(shù)器械1套，靜脈輸液及中心靜脈壓測量裝置1套，連接放血、儲血裝置1套，膀胱插管及計滴器裝置1套； 注射器數(shù)支，試管2支，小燒杯1個，線繩（黑色、白色粗線)若干。 3％戊巴比妥鈉，生理鹽水，0.3％肝素，臺氏液，中分子右旋糖苷，去甲腎上腺素，654-2，7.5%NaCl溶液，5%葡萄糖生理鹽水。 【實驗對象】 家兔 【實驗方法和步驟】 一．動物準備和手術(shù) 1. 動物稱重，麻醉，固定 正確捉拿家兔1只，稱重，耳緣靜脈緩慢注射3％戊巴比妥鈉1ml/kg使動物麻醉，麻醉成功標準：四肢肌緊張減低，角膜反射消失，呼吸深而平穩(wěn)。 將家兔仰臥于兔手術(shù)臺上，固定四肢及頭部。 2．頸部手術(shù) 剪去頸部正中的被毛，作長約5~7cm的正中切口，鈍性分離皮下組織。頸部手術(shù)分離氣管、右側(cè)頸外靜脈、左側(cè)頸總動脈。依次進行： （1)氣管插管 氣管插管的一側(cè)側(cè)管連接呼吸流量換能器，記錄呼吸。 （2)頸外靜脈插管 目的是：①建立靜脈輸液或給藥途徑；②測量中心靜脈壓，當插管接近右心房，可見液面隨呼吸而波動。插管完成后，慢速點滴生理鹽水（5~10滴/min)，以保持插管的通暢以及維持尿的生成。 （3)左側(cè)頸總動脈插管 通過“三通”連接血壓傳感器和放血用儲血瓶。 3．下腹部手術(shù) 膀胱插管。請參照第三章相關(guān)內(nèi)容。 4．全身血液肝素化 耳緣靜注射肝素（625u/ml)，劑量為1ml/kg，此后每隔1h注射1ml維持。 5．連接BL-420E生物信號系統(tǒng)（見圖6-6)， 1通道測量血壓連接動脈插管壓力換能器、2通道測量呼吸連接呼吸流量換能器、3通道作尿量計滴連接計滴器，分別調(diào)整適當?shù)膮?shù)描記血壓、呼吸和尿量。
圖 6-6 兔失血性休克示意圖 二．組織（微循環(huán))血流觀察項目及指標 1. 皮膚粘膜血管和尿量 觀察球結(jié)合膜血管口徑及血流；提起耳殼，對光透現(xiàn)血管口徑及血流；用計滴器記錄尿量，若家兔無尿，通過頸外靜脈緩慢滴入少量生理鹽水，使家兔尿量維持在6~8滴/min。 2. 正常家兔腸系膜微循環(huán)活體鏡檢觀察 在左腹直肌旁作6cm縱行的切口腹壁，鈍性分離肌肉；打開腹腔后，將卵圓孔外科腸鉗伸入左下腹側(cè)（緊貼前腹壁)；鉗出一段小腸袢（一般是闌尾末端上8~12cm處的回腸袢)，平展并固定于恒溫微循環(huán)灌流盒內(nèi)，以38°C臺氏液恒溫灌流；用微循環(huán)顯微鏡連接BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，觀察家兔小腸系膜微循環(huán)變化。 首先在鏡下確認粗、細有別，血流方向相反的微動脈、微靜脈和僅能讓一個紅細胞通過的毛細血管。微動脈的血流速度較快，靜脈內(nèi)血色較暗。然后，固定某一區(qū)域，連續(xù)觀察毛細血管袢數(shù)目、血流速度、血流量及血管口徑（可用測微器或?qū)ｉT儀器)改變。 三．復(fù)制失血性休克動物模型 觀察記錄正常血壓、呼吸、尿量等指標和微循環(huán)血流的變化。復(fù)制失血性休克時，撥動“三通”停止輸液，連通水檢壓計和靜脈插管，可見水檢壓計的液面下降。當液面不再下降并隨呼吸而波動，即為中心靜脈壓（CVP)，記錄數(shù)據(jù)。分別進行： 1．少量失血 撥動連接動脈插管、壓力換能器和儲血瓶的“三通”，使血液（約10ml)從頸總動脈流入預(yù)先注有10ml 0.3％肝素的儲血瓶，恢復(fù)“三通”原來的位置，觀察皮膚粘膜、血壓、呼吸、尿量和微循環(huán)的變化。（全血量按體重的8%計算，或70ml/kg，10ml血液約占血容量百分之幾？)。 2. 大量失血：少量失血10分鐘后，待家兔血壓代償性恢復(fù)正常，再打開“三通”，在3~5min（切勿過快)內(nèi)讓失血量達全血量20%~25%，觀察上述指標的變化。要求血壓下降至5.32kPa(40mmHg)左右，不應(yīng)低于4kPa(30mmHg)。如果血壓回升，可再放一定量的血。使整個觀察期內(nèi)血壓始終維持在4~5.32kPa水平，即失血性休克狀態(tài)。 兩次失血后都應(yīng)觀察記錄如下指標的變化： ⑴實驗兔一般情況，皮膚粘膜、球（瞼)結(jié)合膜血管口徑及血流； ⑵CVP、BP、心率、呼吸、尿量； ⑶微循環(huán)的變化：大量失血后，毛細血管口徑縮小，失血性休克持續(xù)一段時間后，毛細血管血流速度和血流量逐漸下降，部分微血管內(nèi)（尤其在微靜脈)可見白細胞附壁翻滾。 四．實驗性治療 根據(jù)失血性休克的病理生理變化，按休克發(fā)病學(xué)的防治原則（擴容、糾酸、應(yīng)用血管活性藥物和防治細胞損傷等)治療，從下列藥物中自行設(shè)計3種搶救方案（其中必須包括去甲腎上腺素)。藥物可從靜脈途徑輸入，觀察并比較各項救治措施后血壓、CVP和尿量等指標以及微循環(huán)的變化。 ⑴ 去甲腎上腺素：0.2mg溶于10ml生理鹽水中，5min內(nèi)靜脈滴注； ⑵ 5％葡萄糖生理鹽水（輸液的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑶ 7.5%NaCl溶液（輸入的量一般為失血量的1/3)； ⑷ 654-2：2mg溶于25ml生理鹽水中，靜脈滴注（20min輸完)； ⑸ 中分子右旋糖苷：靜脈滴入（輸入的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑹ 0.01%異丙腎上腺素1ml，靜脈注射； ⑺ 全血：將放出的血液經(jīng)抗凝后全部倒入輸液瓶內(nèi)，快速輸回。緊急情況下，可考慮經(jīng)動脈逆行（向心臟方向)快速注入。 搶救治療后，再復(fù)查動物一般情況，觀察上述各項指標的變化。 五．處死動物 耳緣靜脈注射空氣5~10ml。 【實驗注意事項】 1. 在整個實驗過程中，均需保持動脈靜脈插管與血管平行，以免刺破血管。 2. 保護耳緣靜脈，注射時應(yīng)先從耳遠端進針，如不成功，再向耳根部移位。 3. 血管分離時要盡可能剔除脂肪和結(jié)締組織。 4. 排空后的膀胱壁較厚，應(yīng)選擇血管最少的部位剪開插管，插管前一定要把膀胱壁各層（漿膜、肌層、粘膜下層和粘膜)剪破。 5. 本實驗手術(shù)操作多，應(yīng)盡量減少手術(shù)性出血和休克，如手術(shù)過程中失血過多時可先插頸外靜脈輸液。 6. 動脈插管前，要把家兔肝素化；插管前要把插管先充滿肝素生理鹽水，排出氣泡；靜脈插管一經(jīng)插入，應(yīng)立刻緩慢滴注生理鹽水，以防凝血。輸液量不能過多，以免導(dǎo)致肺水腫等合并癥。 7. 正確旋轉(zhuǎn)“三通”。 8. 先停止輸液，再進行失血性的實驗；在整個失血性實驗過程，不再輸液，觀察中心靜脈壓的變化。 9. 注意分工合作，保持實驗臺面整潔。 【討論思考題】 1. 討論實驗動物失血前、后各項指標變化的機理，什么證據(jù)說明家兔己發(fā)生了失血性休克？請闡明微循環(huán)處于什么階段以及理由。 2. 根據(jù)實驗所見指標能否完全闡明關(guān)于休克發(fā)生機制的現(xiàn)代理論？為什么？ 3. 在失血性休克中，血壓的變化和微循環(huán)的變化是否一致？為什么？ 4. 抗休克藥的作用機制是否相同？ 附：實驗結(jié)果記錄參考表（表6-6)。 表 6-6 失血性休克及其搶救過程中各項指標的變化 BP CVP 心 率 呼 吸 尿 量 耳朵結(jié)膜血管 (mmHg) (cmH2O) (次/min) 次/min 深度 （滴/min) 實驗前 小量失血 大失血 NE 7.5%NaCl 輸血 …
微循環(huán)觀察及失血性休克 【實驗?zāi)康摹?/B> 1. 觀察微循環(huán)以及在失血性休克的變化； 2. 復(fù)制失血性休克的動物模型，觀察休克發(fā)生發(fā)展過程中血壓和微循環(huán)血流等的變化，加深對于“休克發(fā)病的關(guān)鍵不在于血壓，而在于血流”的理論認識。 3. 設(shè)計搶救方案，加深對休克防治原則及所用藥物藥理作用的理解，培養(yǎng)獨立分析問題、解決問題的能力。 【實驗原理】 微循環(huán)是指微動脈至微靜脈之間的血液循環(huán)。典型的微循環(huán)由微動脈、后微動脈、毛細血管前括約肌、毛細血管網(wǎng)、直捷通路、動-靜脈吻合支和微靜脈等部分組成。按照微循環(huán)學(xué)說，休克發(fā)生的關(guān)鍵是微循環(huán)灌流障礙；根據(jù)病情進展，微循環(huán)變化可分為缺血性缺氧期、淤血性缺氧期和微循環(huán)衰竭期。 導(dǎo)致休克的原因有多種，其始動環(huán)節(jié)都是血容量急性降低、急性心泵功能障礙和血管容量迅速擴大。家兔的血容量可按體重（g)乘以8%來估算（ml)。急性出血，出血量在血容量的10%以下，機體通過代償機制可不表現(xiàn)癥狀；出血量達20~30%，動物發(fā)生休克；出血量達50%，動物死亡。 失血性休克的臨床表現(xiàn)是血壓明顯下降、皮膚蒼白、四肢冰冷、尿量減少、中心靜脈壓下降, 此外還有心率、呼吸增快等。 搶救休克的原則是去除病因、擴容、糾酸、合理使用血管活性物質(zhì)、使用藥物保護細胞以及防止器官衰竭。據(jù)此，同學(xué)們可自行設(shè)計搶救方案。 【實驗器材和藥品】 BL-420E生理科學(xué)實驗系統(tǒng)，兔手術(shù)臺，壓力換能器，呼吸流量換能器，BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，恒溫灌流盒，哺乳動物手術(shù)器械1套，靜脈輸液及中心靜脈壓測量裝置1套，連接放血、儲血裝置1套，膀胱插管及計滴器裝置1套； 注射器數(shù)支，試管2支，小燒杯1個，線繩（黑色、白色粗線)若干。 3％戊巴比妥鈉，生理鹽水，0.3％肝素，臺氏液，中分子右旋糖苷，去甲腎上腺素，654-2，7.5%NaCl溶液，5%葡萄糖生理鹽水。 【實驗對象】 家兔 【實驗方法和步驟】 一．動物準備和手術(shù) 1. 動物稱重，麻醉，固定 正確捉拿家兔1只，稱重，耳緣靜脈緩慢注射3％戊巴比妥鈉1ml/kg使動物麻醉，麻醉成功標準：四肢肌緊張減低，角膜反射消失，呼吸深而平穩(wěn)。 將家兔仰臥于兔手術(shù)臺上，固定四肢及頭部。 2．頸部手術(shù) 剪去頸部正中的被毛，作長約5~7cm的正中切口，鈍性分離皮下組織。頸部手術(shù)分離氣管、右側(cè)頸外靜脈、左側(cè)頸總動脈。依次進行： （1)氣管插管 氣管插管的一側(cè)側(cè)管連接呼吸流量換能器，記錄呼吸。 （2)頸外靜脈插管 目的是：①建立靜脈輸液或給藥途徑；②測量中心靜脈壓，當插管接近右心房，可見液面隨呼吸而波動。插管完成后，慢速點滴生理鹽水（5~10滴/min)，以保持插管的通暢以及維持尿的生成。 （3)左側(cè)頸總動脈插管 通過“三通”連接血壓傳感器和放血用儲血瓶。 3．下腹部手術(shù) 膀胱插管。請參照第三章相關(guān)內(nèi)容。 4．全身血液肝素化 耳緣靜注射肝素（625u/ml)，劑量為1ml/kg，此后每隔1h注射1ml維持。 5．連接BL-420E生物信號系統(tǒng)（見圖6-6)， 1通道測量血壓連接動脈插管壓力換能器、2通道測量呼吸連接呼吸流量換能器、3通道作尿量計滴連接計滴器，分別調(diào)整適當?shù)膮?shù)描記血壓、呼吸和尿量。
圖 6-6 兔失血性休克示意圖 二．組織（微循環(huán))血流觀察項目及指標 1. 皮膚粘膜血管和尿量 觀察球結(jié)合膜血管口徑及血流；提起耳殼，對光透現(xiàn)血管口徑及血流；用計滴器記錄尿量，若家兔無尿，通過頸外靜脈緩慢滴入少量生理鹽水，使家兔尿量維持在6~8滴/min。 2. 正常家兔腸系膜微循環(huán)活體鏡檢觀察 在左腹直肌旁作6cm縱行的切口腹壁，鈍性分離肌肉；打開腹腔后，將卵圓孔外科腸鉗伸入左下腹側(cè)（緊貼前腹壁)；鉗出一段小腸袢（一般是闌尾末端上8~12cm處的回腸袢)，平展并固定于恒溫微循環(huán)灌流盒內(nèi)，以38°C臺氏液恒溫灌流；用微循環(huán)顯微鏡連接BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，觀察家兔小腸系膜微循環(huán)變化。 首先在鏡下確認粗、細有別，血流方向相反的微動脈、微靜脈和僅能讓一個紅細胞通過的毛細血管。微動脈的血流速度較快，靜脈內(nèi)血色較暗。然后，固定某一區(qū)域，連續(xù)觀察毛細血管袢數(shù)目、血流速度、血流量及血管口徑（可用測微器或?qū)ｉT儀器)改變。 三．復(fù)制失血性休克動物模型 觀察記錄正常血壓、呼吸、尿量等指標和微循環(huán)血流的變化。復(fù)制失血性休克時，撥動“三通”停止輸液，連通水檢壓計和靜脈插管，可見水檢壓計的液面下降。當液面不再下降并隨呼吸而波動，即為中心靜脈壓（CVP)，記錄數(shù)據(jù)。分別進行： 1．少量失血 撥動連接動脈插管、壓力換能器和儲血瓶的“三通”，使血液（約10ml)從頸總動脈流入預(yù)先注有10ml 0.3％肝素的儲血瓶，恢復(fù)“三通”原來的位置，觀察皮膚粘膜、血壓、呼吸、尿量和微循環(huán)的變化。（全血量按體重的8%計算，或70ml/kg，10ml血液約占血容量百分之幾？)。 2. 大量失血：少量失血10分鐘后，待家兔血壓代償性恢復(fù)正常，再打開“三通”，在3~5min（切勿過快)內(nèi)讓失血量達全血量20%~25%，觀察上述指標的變化。要求血壓下降至5.32kPa(40mmHg)左右，不應(yīng)低于4kPa(30mmHg)。如果血壓回升，可再放一定量的血。使整個觀察期內(nèi)血壓始終維持在4~5.32kPa水平，即失血性休克狀態(tài)。 兩次失血后都應(yīng)觀察記錄如下指標的變化： ⑴實驗兔一般情況，皮膚粘膜、球（瞼)結(jié)合膜血管口徑及血流； ⑵CVP、BP、心率、呼吸、尿量； ⑶微循環(huán)的變化：大量失血后，毛細血管口徑縮小，失血性休克持續(xù)一段時間后，毛細血管血流速度和血流量逐漸下降，部分微血管內(nèi)（尤其在微靜脈)可見白細胞附壁翻滾。 四．實驗性治療 根據(jù)失血性休克的病理生理變化，按休克發(fā)病學(xué)的防治原則（擴容、糾酸、應(yīng)用血管活性藥物和防治細胞損傷等)治療，從下列藥物中自行設(shè)計3種搶救方案（其中必須包括去甲腎上腺素)。藥物可從靜脈途徑輸入，觀察并比較各項救治措施后血壓、CVP和尿量等指標以及微循環(huán)的變化。 ⑴ 去甲腎上腺素：0.2mg溶于10ml生理鹽水中，5min內(nèi)靜脈滴注； ⑵ 5％葡萄糖生理鹽水（輸液的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑶ 7.5%NaCl溶液（輸入的量一般為失血量的1/3)； ⑷ 654-2：2mg溶于25ml生理鹽水中，靜脈滴注（20min輸完)； ⑸ 中分子右旋糖苷：靜脈滴入（輸入的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑹ 0.01%異丙腎上腺素1ml，靜脈注射； ⑺ 全血：將放出的血液經(jīng)抗凝后全部倒入輸液瓶內(nèi)，快速輸回。緊急情況下，可考慮經(jīng)動脈逆行（向心臟方向)快速注入。 搶救治療后，再復(fù)查動物一般情況，觀察上述各項指標的變化。 五．處死動物 耳緣靜脈注射空氣5~10ml。 【實驗注意事項】 1. 在整個實驗過程中，均需保持動脈靜脈插管與血管平行，以免刺破血管。 2. 保護耳緣靜脈，注射時應(yīng)先從耳遠端進針，如不成功，再向耳根部移位。 3. 血管分離時要盡可能剔除脂肪和結(jié)締組織。 4. 排空后的膀胱壁較厚，應(yīng)選擇血管最少的部位剪開插管，插管前一定要把膀胱壁各層（漿膜、肌層、粘膜下層和粘膜)剪破。 5. 本實驗手術(shù)操作多，應(yīng)盡量減少手術(shù)性出血和休克，如手術(shù)過程中失血過多時可先插頸外靜脈輸液。 6. 動脈插管前，要把家兔肝素化；插管前要把插管先充滿肝素生理鹽水，排出氣泡；靜脈插管一經(jīng)插入，應(yīng)立刻緩慢滴注生理鹽水，以防凝血。輸液量不能過多，以免導(dǎo)致肺水腫等合并癥。 7. 正確旋轉(zhuǎn)“三通”。 8. 先停止輸液，再進行失血性的實驗；在整個失血性實驗過程，不再輸液，觀察中心靜脈壓的變化。 9. 注意分工合作，保持實驗臺面整潔。 【討論思考題】 1. 討論實驗動物失血前、后各項指標變化的機理，什么證據(jù)說明家兔己發(fā)生了失血性休克？請闡明微循環(huán)處于什么階段以及理由。 2. 根據(jù)實驗所見指標能否完全闡明關(guān)于休克發(fā)生機制的現(xiàn)代理論？為什么？ 3. 在失血性休克中，血壓的變化和微循環(huán)的變化是否一致？為什么？ 4. 抗休克藥的作用機制是否相同？ 附：實驗結(jié)果記錄參考表（表6-6)。 表 6-6 失血性休克及其搶救過程中各項指標的變化 BP CVP 心 率 呼 吸 尿 量 耳朵結(jié)膜血管 (mmHg) (cmH2O) (次/min) 次/min 深度 （滴/min) 實驗前 小量失血 大失血 NE 7.5%NaCl 輸血 …
(梁仲培) 心功能的影響因素與實驗性心力衰竭 【實驗?zāi)康摹?/B> 1. 學(xué)習(xí)離體在位蟾蜍心臟的恒壓灌流法，觀察前、后負荷和心肌收縮性能對心功能的影響，并描繪心功能曲線的變化； 2. 制備實驗性全心衰的動物模型；觀察強心藥物對衰竭心肌的治療作用。 【實驗原理】 一般作為衡量心功能的指標是心輸出量（心輸出量ml/min=每搏輸出量ml/次×心率 次/min)。在此次實驗中利用離體在位的蟾蜍心臟，消除了神經(jīng)反射對心率變動的影響，所以相當于在心率基本恒定的情況下，主要考慮每搏輸出量對心輸出量的影響。前者反映了心肌舒縮力量與作功的大小，它受前、后負荷和心肌收縮性等基本因素的影響。在一定范圍內(nèi)，回心血量增加，心室舒張末期容積（前負荷)增加，使心肌纖維初長度拉長，心肌收縮力加強，每搏輸出量增加，即F-Starling定律。當心室后負荷（如大動脈壓)增加時，即心室收縮射血克服阻抗增加，心室壁收縮期張力增大，作功增加。心肌收縮性能改變是指心肌內(nèi)在收縮機制改變所引起的收縮力量的改變，與前、后負荷無關(guān)，而可受去甲腎上腺素、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)和體液因素的影響。改變心肌收縮性能可使心功曲線左移或右移。 本實驗利用硫酸鎘競爭性抑制Ca2+內(nèi)流，降低心肌收縮性制備出全心衰模型。 洋地黃因使心肌細胞膜Na+-K+-ATP酶活性減低，異丙腎上腺素則作為膜β受體激動劑，對衰竭心肌都有一定治療作用，而普奈洛爾作為β受體阻斷劑，可拮抗β受體激動劑的強心作用。 【實驗器材與藥品】 蛙類手術(shù)器械一套，恒壓灌流裝置一套，10ml量筒，小燒懷，動、靜脈插管，計算，器滴管，坐標紙，任氏液，1:10,000去甲腎上腺素，1:10,000乙酰膽堿，2×10－6～2×10－5mol/L硫酸鎘任氏液，0.2％地高辛，0.2%普奈洛爾（按片劑重量計算)，0.001%異丙腎上腺素。 【實驗對象】 蟾蜍或蛙 【實驗方法和步驟】 一.離體在位心臟灌流標本的制備 1. 破壞蛙腦和脊髓，將其仰臥放在蛙板上，用外科剪于劍突處向兩側(cè)鎖骨肩峰端呈三角形剪開皮膚，用粗剪剪開胸壁，切勿損傷心臟，剪去胸骨、鎖骨，用蛙釘把兩前肢固定在蛙板上。用鑷子提起心包膜，用眼科剪仔細將其剪開，暴露心臟。 2. 分離出左、右主動脈，在其下方穿兩根線備用。用玻璃分針將心臟翻向頭側(cè)，可看到靜脈竇與下腔靜脈（后腔靜脈)。小心分離并剪開與下腔靜脈相連的心包膜組織在其下穿一根線備用。 將剛才穿于主動脈下的其中一根備用線從下腔靜脈下繞過，結(jié)扎此線，便把兩主動脈和下腔靜脈以外的全部血管扎住，結(jié)扎過程中切勿扎到靜脈竇。再把穿于主動脈下方的另一根線結(jié)扎右主動脈（見圖6-7)。 3. 用鑷子夾住下腔靜脈的上壁少許，用剪刀沿鑷子下緣剪一小口，將事先充滿任氏液（不含氣泡)的靜脈插管插入此切口，直至靜脈竇內(nèi)，用備用線結(jié)扎固定。翻轉(zhuǎn)心臟向下，提起左主動脈，在左主動脈盡量長的遠端剪一斜形切口，然后用充滿任氏液的吸管插入心室，沖洗并反復(fù)數(shù)次（目的是避免血液堵塞插管)。注意不要進氣泡。 4、將事先充滿任氏液的動脈插管向心性插入，作為心搏出口，并用線結(jié)扎固定。 5、把靜脈插管與橡皮管1相連，但先不打開夾子；把動脈插管與橡皮管2相連（見圖6-8)。
圖 6-7 蛙心臟示意圖（a、b、c分別為結(jié)扎線) 圖 6-8 離體蛙心恒壓灌流裝置 二. 觀察項目 1. 每分輸出量和有效心功率的計算方法 （1)每分輸出量：用小燒杯收集心臟搏出的灌流液1分鐘，用小量筒測定搏出液量（ml)。同時計數(shù)心率（次/分)。 （2)計算： 有效心功率 = 心輸出量 ′ 心功管高度（側(cè)管高度)′ 水密度 （g×cm/min) （ml/min) （cm) （1g/ml) （3)肉眼觀察心舒張容積、心肌收縮力量變化。 2. 觀察實驗因素對每分輸出量和有效心功率的影響 （1)改變前負荷（后負荷固定)：把皮管2固定在約高于心臟3cm的水平，調(diào)節(jié)貯液瓶高度，使“零點”分別處于5cm、10cm、15cm……等高度，觀察心舒容積和心肌收縮力量的變化，同時分別依次測定各高度下的心輸出量、心率、每搏輸出量并即時算出有效心功率。若有效心功率曲線平移時，便恢復(fù)“零點”在5cm的水平。找出最適前負荷（即心臟不過分充盈擴張而心輸出量又較高的“零點”高度)。注意：“零點”在5cm時，搏出量應(yīng)保持在20~30滴/分（在橡皮管1處用螺旋止水夾控制)。以下個項實驗中所取的固定前負荷=最適前負荷-5cm。 （2)改變后負荷（前負荷固定)：把前負荷固定在“固定前負荷”，改變橡皮管2的高度（每次間距為5cm)觀察并記錄上述（1)中各項指標。 注意：在實驗過程中，每改變一次側(cè)管高度，要穩(wěn)定1~2分鐘，再進行測定。當側(cè)管高度超過心臟代償范圍至有效心功率曲線平移或下降（即心衰)時，就不能再提高側(cè)管高度�；謴�(fù)皮管2約高于心臟3 cm水平，待心輸出量基本達到本項實驗前的水平并以此作為對照，進行以下的實驗。（下面的各次實驗也遵循此原則)。 （3)心肌收縮性能改變：將前后負荷固定，用滴管將1:10,000去甲腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察心率、心輸出量和有效心功率的變化。用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動恢復(fù)后，按上法滴加1:10,000乙酰膽堿1~2滴滴于心臟表面，觀察和記錄上述指標的變化。 （4)異丙腎上腺素：用任氏液沖洗心臟表面，把乙酰膽堿沖洗干凈，待心臟活動恢復(fù)后，用滴管將0.001%異丙腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。 （5)普奈洛爾：用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動恢復(fù)后，按上法滴加0.2%普奈洛爾2~3滴滴于心臟表面，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化,待出現(xiàn)作用時，立即重復(fù)（4)步驟操作。 （6)硫酸鎘：用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動恢復(fù)后，用2′10-6mol/L硫酸鎘任氏液代替任氏液灌流心臟，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。 （7)強心甙藥物：在用硫酸鎘灌流的心臟出現(xiàn)心衰表現(xiàn)后（心輸出量和有效心功率明顯下降)，用滴管滴加0.2%毒毛旋花子素K（或0.2% 地戈辛)1~2滴于心臟表面，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動恢復(fù)或接近給予強心甙藥物前狀態(tài)后，用滴管將0.001%異丙腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。 【實驗注意事項】 1. 實驗過程中勿用手捏拿心臟，以免損傷心臟。 2. 心臟表面應(yīng)經(jīng)常滴加任氏液，以保持濕潤。 3. 整個實驗過程中，管道不要扭曲。 4. 實驗過程中，應(yīng)回收、循環(huán)使用任氏液或硫酸鎘任氏液。 【討論思考題】 1. 評價心功能指標有哪些？各有何優(yōu)缺點？ 2. 影響心功能的因素有哪些？從心臟本身來分析，那些因素可影響心功能？ 3. 強心苷對心臟有何作用？中毒表現(xiàn)如何？為什么？ 4. 臨床上左、右心衰表現(xiàn)各如何？治療原則及藥物選擇各如何？ 急性肝功能不全及氨在肝性腦病發(fā)病中的作用 【實驗?zāi)康摹?/B> 1. 急性阻斷肝臟血流造成急性肝功能損傷模型，觀察相關(guān)指標的變化； 2. 對經(jīng)不同處理的實驗家兔灌入氯化銨溶液或生理鹽水，觀察出現(xiàn)相應(yīng)癥狀的所需的氯化銨用量，測定各組動物實驗后的血氨水平，探討氨在肝性腦病發(fā)病機制中的作用； 3. 通過各組動物的不同處理，進一步加深對醫(yī)學(xué)研究設(shè)計的理解。 【實驗原理】 正常情況下，肝細胞通過鳥氨酸循環(huán)把2個氨分子合成為1個尿素分子，再由腎臟排出體外，使血氨的來源和清除保持動態(tài)平衡。本實驗人為地阻斷肝臟的血流，造成肝細胞功能急性損傷，從而使谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT)活性升高，鳥氨酸循環(huán)障礙。 肝性腦病是繼發(fā)于嚴重肝功能損害的精神神經(jīng)綜合癥。關(guān)于其發(fā)病機制尚未完全闡明。目前有氨中毒學(xué)說、假性神經(jīng)介質(zhì)學(xué)說、血漿氨基酸失衡學(xué)說、g-GABA學(xué)說和綜合學(xué)說等。氨中毒學(xué)說中心內(nèi)容是肝性腦病的發(fā)生與血氨升高密切相關(guān)。本實驗在人為地阻斷肝臟的血流、造成肝功能急性損傷的同時，再經(jīng)消化道灌入復(fù)方氯化銨溶液，使血氨水平明顯升高，產(chǎn)生類似肝性腦病的臨床表現(xiàn)。 【實驗器材和藥品】 哺乳動物手術(shù)器械1套，兔臺，胃管（用人的導(dǎo)尿管代替)，粗棉線1根，三角縫針和小圓針各1根，血氨測定用的器材1套；5ml試管10支，離心機，恒溫水浴箱，722型分光光度計； 1%普魯卡因，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4), 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液, 2,4-二硝基苯肼溶液，0.4mmol/L NaOH溶液, 丙酮酸標準液(2mmol/ml)； 2.5%復(fù)方氯化銨溶液（5%葡萄糖溶液100ml中加入氯化銨2.5g，碳酸氫鈉1.5g)，生理鹽水，無氨水； 10%鎢酸鈉，硫酸銨標準液，0.5mmol/L硫酸，顯色Ⅰ液，顯色Ⅱ液；（供血濾液直接測定血氨法用，若用血氨測定試劑盒則不必準備)； 血氨測定試劑盒，尿素測定試劑盒。 【實驗對象】 家兔 【實驗方法和步驟】 一．從耳中央動脈取血制備血清 將家兔置于兔固定箱內(nèi)，在兔耳的中央有一條較粗、顏色較鮮紅的中央動脈，用左手固定兔耳，右手取注射器，在中央動脈的末端，沿著動脈平行地向心方向刺入動脈，即可見動脈血進入針筒，取血3ml制備血清備用。取血完畢后注意止血。由于兔耳中央動脈容易痙攣，故抽血前必須讓兔耳充分充血，采血時動作要迅速。采血所用針頭不要太細，一般用6號針頭。 二．急性肝功能不全動物模型的制備及分組 1. 手術(shù) 取家兔3只，進行如下操作： ⑴ 將家兔稱重后，固定于兔臺上。剪去上腹部被毛，在正中切口部位用0.1%普魯卡因5ml作皮下浸潤麻醉；切開皮膚，長約5~6cm；再沿腹白線切開腹壁進入腹腔，可見肝等內(nèi)臟。 ⑵ 結(jié)扎肝門區(qū)血管：用手輕壓肝表面，在肝和膈肌之間可見一透明、呈三角形的鐮狀韌帶。小心用眼科剪將其剪斷（切莫損傷膈肌)。 ⑶ 將3只家兔分為甲、乙、丙3組。甲和丙組把粗棉線放置于家兔肝門區(qū)，除右外葉和尾葉外，將肝左外側(cè)葉、左中葉和右中葉翻出并用力結(jié)扎。使大部分肝血流阻斷，因而模擬急性肝功能不全。乙兔不結(jié)扎肝葉，肝功能正常。 ⑷ 十二指腸插管：沿胃幽門向下找出一段十二指腸，用帶有絲線的小圓針穿越腸壁4～5針，圍成一個小圓圈。再用眼科剪在圓圈內(nèi)血管少的腸壁作一小切口，將胃管順十二指腸遠端方向插入腸腔5cm。結(jié)扎并固定胃管后，用三角縫針將腹壁做連鎖縫合，關(guān)閉腹壁，把家兔松開。 2. 實驗觀察 觀察家兔的一般狀況、呼吸、肌張力、角膜反射和痛覺反射等指標后，小腸插管家兔小腸內(nèi)每隔5min灌入如下溶液：甲和乙兔灌入2.5%復(fù)方氯化銨溶液3ml/kg；丙兔灌入生理鹽水3ml/kg。每次灌藥前觀察上述指標的變化。 甲兔灌入復(fù)方氯化銨溶液后呼吸逐漸變得深快或深大，肌張力減弱、頸軟、頭垂、四肢無力、痛覺反射和角膜反射遲鈍，灌藥5~6次左右，甲兔痙攣抽搐、角弓反張。請實驗者一邊觀察，一邊思考癥狀為什么會出現(xiàn)。 三. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血氨和尿素氮的檢測 在甲兔第一次痙攣抽搐發(fā)作時，固定甲兔于兔臺上，先從耳中央動脈取血3ml制備血清備用；再用抗凝注射器心臟采血5ml，作血氨和尿素氮（BUN)的測定。 1. 按附錄的方法測定家兔實驗前后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT)的活力。 2. 血氨和血尿素氮（BUN)的測定：分別按試劑盒方法或附錄的方法測定血氨（1ml)和血尿素氮。 其它組家兔按甲兔出現(xiàn)痙攣抽搐的時間進行用上述方法取血，測定GPT活力、血氨和BUN。 注：各組家兔都做谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血氨的測定；由于測定血漿BUN條件要求較高，甲、乙、丙兔可各選一組家兔進行血漿BUN測定（方法參照試劑盒進行)。 【實驗注意事項】 1. 游離肝臟和剪破鐮狀韌帶的動作準確、輕柔，以免肝葉破裂出血和損傷膈肌造成氣胸；結(jié)扎肝臟時，粗棉線要置于肝葉根部避免勒破肝臟，要用力結(jié)扎，阻斷肝臟的血液供應(yīng)。 2. 心臟取血方法可參照附錄或第三章相關(guān)內(nèi)容。注射器要肝素化并干燥，以免溶血；入針部位要準確，垂直進針，深度適當；動作要輕柔、迅速，盡可能縮短針頭在心臟停留的時間，防止凝血；針頭進入胸壁后不能左右擺動，以免損傷心、肺。 3. 血氨的測定可按照試劑盒提供的方法進行或參照附錄的血濾液直接測定法進行。 4．尿素氮的測定要按照試劑盒提供的方法進行。 【討論思考題】 1. 結(jié)扎肝門血管以及灌入氯化銨是否復(fù)制肝性腦病的動物模型？為什么？ 2. 為什么要設(shè)立甲、乙、丙兔，作用何在？ 3. 灌入復(fù)方氯化銨溶液后，甲兔的呼吸如何變化？為什么？ 4. 哪些指標說明肝功能損傷? 它們之間有何關(guān)系？道理何在？ 5. 氯化銨在哪些方面對CNS起作用？ 6. 根據(jù)氨中毒學(xué)說和上面的實驗結(jié)果推理，現(xiàn)設(shè)計一組小鼠實驗方案，給藥劑量和分組見表6-13。 表中5只小鼠腹腔注入不同試劑后會出現(xiàn)什么表現(xiàn)？小鼠可能發(fā)生死亡的次序是什么？本實驗說明什么問題？ 表 6-13 小鼠氨中毒的實驗設(shè)計 鼠號 | 十二指腸或腹腔注射試劑 | 劑量 | 死亡次序 | 1 | 0.85%NaCl溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 2 | 2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 3 | 0.5%醋酸，2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 4 | 2.5%NH4Cl, 1.5%NaHCO3溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 5 | 50%谷氨酸鈉，2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g體重 | |
【附錄】 1．心臟取血：家兔的心臟在胸骨后正中央，約在第三至第五肋間。取血時，將家兔仰臥，在第三肋間胸骨左緣（兩前肢下緣連線與胸骨左緣交界)3mm處，或以左手拇指在胸骨一側(cè)，食指及中指于胸骨另側(cè)固定心臟，在心尖搏動最明顯處將采血針與胸壁垂直刺入胸腔內(nèi)約2.5~3cm，當持針手感到心臟搏動時，再稍刺入即入心腔。然后抽出血液。取血時，針頭宜直入直出，勿在胸腔內(nèi)左右探索。 2．谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT)活性測定（賴氏法) GPT催化L-丙氨酸和a-酮戊二酸的反應(yīng)，生成丙酮酸和L-谷氨酸。一般以在一定的時間內(nèi)生成的丙酮酸多少確定GPT活力。丙酮酸能與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成黃色的丙酮酸-2,4二硝基苯肼，在堿性溶液中呈棕紅色。顏色的深淺與丙酮酸的量成正比�？赏ㄟ^同樣處理的丙酮酸標準液比較，算出GPT的活力。具體方法如下： ⑴ 標準曲線的制備（實驗前準備)：取試管6支，按表6-14操作 表 6-14 丙酮酸標準曲線制作的步驟 加入物（ml) | 空白管 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 丙酮酸標準液(2mmol/L) | 0 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液 | 0.50 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 | 0.25 | 37°C水浴預(yù)溫5min | 2,4-二硝基苯肼溶液 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 37°C水浴預(yù)溫20min | 0.4mol/L NaOH溶液 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 丙酮酸實際含量(mmol) | 0 | 0.10 | 0.20 | 0.30 | 0.40 | 0.50 | 相當于GPT活力單位 | 0 | 28 | 57 | 97 | 150 | 200 |
加入0.4mol/L NaOH溶液后混勻，10分鐘后在520nm波長下比色，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度。以吸光度與活力單位繪制標準曲線。 ⑵ 血清GPT活力測定：取試管2支，按表6-15操作。 表 6-15 血清GPT活力測定步驟 加入物（ml) | 測定管 | 對照管 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液 | 0.50 | - | 37°C水浴預(yù)溫5min | 血清 | 0.10 | 0.10 | 搖勻，37°C水浴，準確保溫30min | 2,4-二硝基苯肼溶液 | 0.50 | 0.50 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液 | - | 0.50 | 搖勻，37°C水浴，保溫20min | 0.4mol/L NaOH溶液 | 5.0 | 5.0 |
混勻,靜置10min后，用蒸餾水調(diào)零,在520nm波長比色.測定管吸光度減去對照管吸光度后，從標準曲線上查出酶活力單位。 3. 氨定量測定--血濾液直接測定血氨方法 取試管3支，分別標為測定管（u)、標準管（s)和空白管（b)，嚴格按下表的順序先加入10%鎢酸鈉1ml，再分別加入全血1ml、硫酸銨標準液1ml、無氨水1ml，用小玻棒混勻，再加入0.5mol/L硫酸1ml，混勻。見表6-16。 表 6-16 氨定量測定步驟 | 測定（u)ml | 標準（s)ml | 空白（b)ml | 10%鎢酸鈉 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 全血 | 1.0 | / | / | 硫酸銨標準液 | / | 1.0 | / | 無氨水 | / | / | 1.0 | 0.5mol/L硫酸 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
混勻后，離心沉淀（1500~2000轉(zhuǎn)′10分鐘)。 另取試管3支按表6-17操作。 表 6-17 血氨測定顯色步驟 | 測定（u)ml | 標準（s)ml | 空白（b)ml | 上清液 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 顯色Ⅰ液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 顯色Ⅱ液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
混勻后，置37°C水浴中20分鐘。然后用722分光光度計以620nm波長比色，空白調(diào)零。血氨計算：Du/Ds=血氨氮（mg/L)。 （注：我們用該法測定46只健康家兔空腹血氨水平為1.23±0.47mg/L)。 4．應(yīng)用試劑盒測定血氨按試劑盒提供的方法進行。 5．血尿素氮測定按試劑盒上的方法進行。 6．實驗結(jié)果可參考表6-18記錄： 表 6-18 各組家兔癥狀及GPT、血氨、尿素氮的變化 組別 | 癥狀 | 劑量 | GPT（IU) | 血氨(mg/L) | 血BUN(mg/L) | | 呼吸深快 | 肌無力 | 抽搐 | （ml/kg) | 實驗前 | 實驗后 | 實驗前 | 實驗后 | 實驗前 | 實驗后 | 甲 | | | | | | | 1．23 ±0.47 | | 280±98 | | 乙 | | | | | | | | | 丙 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
注: 家兔實驗前血BUN數(shù)據(jù)引自南京醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室。 | 
