藥物分析-授課教案:第六章　芳酸及其酯類藥物分析

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

第六章 芳酸及其酯類藥物的分析

芳酸及其酯類藥物分子結(jié)構(gòu)的www.med126.com共性：既具有苯環(huán)，又有羧基，或另有取代基。

（1)水楊酸類；（2)苯甲酸類藥物；（羧基直接與苯環(huán)相連)；（3)其他芳酸及其酯類藥物（羧基為磺酸基或通過(guò)烴氧基等與苯環(huán)相連者)。

第一節(jié) 水楊酸類藥物的分析

一、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

常用的水楊酸類藥物結(jié)構(gòu)如下：

主要理化性質(zhì)

  1.溶解行為：成鹽者易溶于水，其他藥物溶于有機(jī)溶劑。

2.酸性：屬于中等強(qiáng)度的酸或弱酸。

3.取代基（鹵素、硝基、羥基)增加氧氫鍵極性，較易離解出質(zhì)子，故酸性較苯甲酸強(qiáng)；取代基（甲基、氨基)降低氧氫鍵極性，使酸性較苯甲酸弱。

4.水楊酸：羥基與羧基有鄰位效應(yīng)，并能形成分子內(nèi)氫鍵，酸性增強(qiáng)。

5．芳酸酯類藥物易水解而分解，如阿司匹林、雙水楊酯。

講授結(jié)合多媒體教學(xué)以及課堂討論和練習(xí)

復(fù)習(xí)舊課（3min)

引入新課（2min)

5min

注意：貝諾酯的命名：4-羥基乙酰苯胺的乙酰水楊酸酯；雙水楊酯的命名：2－羥基苯甲酸－2－羧基苯酯。

10min

重點(diǎn)講解分子內(nèi)氫鍵，在含量測(cè)定中的水解后剩余滴定法中要涉及此項(xiàng)內(nèi)容。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（一)三氯化鐵反應(yīng)

本類藥物具有酚羥基或水解后能產(chǎn)生酚羥基，可在中性或弱酸性條件下，與三氯化鐵試液反應(yīng)，生成紫堇色鐵配位化合物。反應(yīng)適宜的pH值為4～6，在強(qiáng)酸性溶液中配位化合物分解。 

本反應(yīng)極為靈敏，只需取稀溶液進(jìn)行試驗(yàn)；如取樣量大，產(chǎn)生顏色過(guò)深時(shí)，可加水稀釋后觀察。

（二)重氮化－偶合反應(yīng)

分子結(jié)構(gòu)中具有芳伯氨基（對(duì)氨基水楊酸鈉)或潛在芳伯氨基（貝諾酯)的藥物，加酸水解后產(chǎn)生芳伯氨基結(jié)構(gòu)，在酸性溶液中，與亞硝酸鈉試液進(jìn)行重氮化反應(yīng)，生成的重氮鹽與堿性β－萘酚偶合產(chǎn)生橙紅色沉淀。

貝諾酯

（橙紅色)

5min

復(fù)習(xí)無(wú)機(jī)化學(xué)中的知識(shí)：

在配位化合物中，要知道中心離子、配位體和外界離子。

5min

復(fù)習(xí)有機(jī)化學(xué)中的相關(guān)知識(shí)：

重氮化反應(yīng)：

在反應(yīng)過(guò)程中，由于亞硝酸易分解，可直接用鹽酸和亞硝酸鈉在低溫下進(jìn)行反應(yīng)。

偶合反應(yīng)：

一般在鄰、對(duì)位發(fā)生。

－N=N－為偶氮基。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（三)水解反應(yīng)

　　阿司匹林

阿司匹林與碳酸鈉試液加熱水解，得水楊酸鈉及醋酸鈉，加過(guò)量稀硫酸酸化后，則析出白色水楊酸沉淀，并發(fā)生醋酸的臭氣。沉淀物于100～105℃干燥后，熔點(diǎn)為156～161℃。

雙水楊酯亦能產(chǎn)生類似的水解反應(yīng)。

（四)紫外吸收光譜法

(1)利用紫外特征吸收法

貝諾酯無(wú)水乙醇溶液： λ_max為240nm；為730～760；

水楊酸二乙胺乙醇溶液：λ_max為227nm、297nm，λ_min為 257nm。

(2)利用雙波長(zhǎng)吸收度比法

對(duì)氨基水楊酸鈉（pH 7磷酸鹽緩沖液)：A₂₆₅/A₂₉₅的值應(yīng)在1.50～1.56之間。

（五)紅外吸收光譜

水楊酸的紅外吸收?qǐng)D譜如下：

7min

請(qǐng)同學(xué)解釋：

此處酚羥基為什么沒有成鈉鹽？

3min

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

水楊酸的紅外吸收?qǐng)D譜分析

對(duì)氨基水楊酸鈉的紅外吸收?qǐng)D譜如下：

對(duì)氨基水楊酸鈉的紅外吸收?qǐng)D譜分析

10min,

注意取代基團(tuán)對(duì)羥基、羧基、苯環(huán)的影響。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

課間休息十分鐘

三、特殊雜質(zhì)檢查

(一)、阿司匹林中特殊雜質(zhì)的檢查

1、合成工藝

2、檢查

（1)溶液的澄清度：利用溶解行為的差異，檢查碳酸鈉試液中不溶物。阿司匹林可溶于碳酸鈉試液，而雜質(zhì)不溶。不溶物雜質(zhì)：未反應(yīng)完全的酚類，或水楊酸精制時(shí)溫度過(guò)高，產(chǎn)生脫羧副反應(yīng)的苯酚，及合成中由副反應(yīng)生成的醋酸苯酯、水楊酸苯酯和乙酰水楊酸苯酯等。

5min

Ch.P(2005)

^{【檢查】  溶液的澄清度  取本品0.50g ，加溫?zé)嶂良s45℃的碳酸鈉試液10ml溶解后，溶液應(yīng)澄清。}  

酚類：

酯類：

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（2)水楊酸：由生產(chǎn)過(guò)程中乙�；�不完全或貯藏過(guò)程中水解產(chǎn)生。水楊酸對(duì)人體有毒性，而且分子中酚羥基在空氣中被逐漸氧化成一系列醌型有色物質(zhì)，如淡黃、紅棕甚至深棕色，使阿司匹林成品變色。

檢查原理：利用阿司匹林結(jié)構(gòu)中無(wú)酚羥基，不能與高鐵鹽作用，而水楊酸則可與高鐵鹽反應(yīng)生成紫堇色，與一定量水楊酸對(duì)照液生成的色澤比較，從而控制游離水楊酸的限量。

檢查方法：取本品0.1g，加乙醇1ml溶解后，加冷水適量使成50ml，立即加新制的稀硫酸鐵銨溶液[取鹽酸溶液（9 100)1ml，加硫酸鐵銨指示液2ml后，再加水適量使成100ml] 1ml，搖勻；30秒鐘內(nèi)如顯色，與對(duì)照液（精密稱取水楊酸0.1g，加水溶解后加冰醋酸1ml，搖勻，再加水使成1000ml，搖勻，精密量取1ml，加乙醇1ml，水48ml，與上述新制的稀硫酸鐵銨溶液1ml，搖勻)比較，不得更深。其限量為0.1％。

由于阿司匹林在制劑過(guò)程中又易水解為水楊酸，因此藥典規(guī)定阿司匹林片劑和腸溶片均按上述類似方法控制雜質(zhì)水楊酸的限量，限量分別為：0.3％和1.5％；阿司匹林栓（HPLC法)水楊酸限量：1.0％。

（3)易炭化物：

5min

5min

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（二)對(duì)氨基水楊酸鈉中特殊雜質(zhì)的檢查

1、合成工藝與氨基酚雜質(zhì)的產(chǎn)生 

間氨基酚雜質(zhì)的產(chǎn)生

原料殘存

脫羧產(chǎn)生

中國(guó)藥典（2005年版)利用對(duì)氨基水楊酸鈉不溶于乙醚，而間氨基酚（雜質(zhì))易溶于乙醚的特性，使二者分離后，在乙醚中加入適量水，用鹽酸滴定液（0.02mol/L)滴定，以消耗一定體積量鹽酸滴定液來(lái)控制其限量。該法為雙相滴定法，所生成的鹽酸鹽在乙醚中不溶，而轉(zhuǎn)入水相中。

中國(guó)藥典（2005年版)對(duì)氨基水楊酸鈉檢查項(xiàng)方法如下：

【檢查】

　　　　間氨基酚　^{取本品，研細(xì)，稱取3.0g，置50ml燒杯中，加用熔融氯化鈣脫水的乙醚25ml，用玻璃棒攪拌1 分鐘，注意將乙醚溶液濾入分液漏斗中，不溶物再用脫水的乙醚提取 2次，每次25ml，乙醚液濾入同一分液漏斗中，加水10ml與甲基橙指示液1 滴，振搖后，用鹽酸滴定液(0.02mol/L) 滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，消耗}

^{鹽酸滴定液(0.02mol/L) 不得過(guò)0.30ml。}

10min

有機(jī)相  

水相

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

高效液相色譜法

USP (23)采用ion-pair HPLC法檢查間氨基酚的限量。

色譜條件 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠(C₁₈，10μm)，色譜柱為（250mm×4.6mm)；流動(dòng)相為NaH₂PO₄液（0.05mol/L)－Na₂HPO₄液（0.05mol/L)－甲醇（含氫氧化四丁基銨1.9g)（425：425：150)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；流速約1.5ml/min。

貯備液配制  均用流動(dòng)相為溶劑。內(nèi)標(biāo)溶液為磺胺溶液(5μg/ml)；對(duì)照品貯備液為間氨基酚溶液(12μg/ml)；供試品貯備液為對(duì)氨基水楊酸鈉溶液(6.9mg/ml)。

對(duì)照品溶液制備  精密量取對(duì)照品貯備液和內(nèi)標(biāo)溶液各10ml，置于100ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，備用。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，間氨基酚峰與內(nèi)標(biāo)磺胺峰的分離度應(yīng)大于2.5；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不宜大于7%(按間氨基酚與內(nèi)標(biāo)峰的響應(yīng)值之比計(jì))。

測(cè)定方法 取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，磺胺與間氨基酚的相對(duì)保留時(shí)間為0.66。

按下式計(jì)算間氨基酚的百分含量：

  間氨基酚的百分含量=10(C/W)(R_U/R_S)

式中C為對(duì)照品溶液中間氨基酚的濃度(μg/ml)，W為供試品溶液中對(duì)氨基水楊酸鈉的含量(mg)，R_U和R_S分別為供試品溶液和對(duì)照品溶液中間氨基酚峰與磺胺峰響應(yīng)值之比。

規(guī)定對(duì)氨基水楊酸鈉中含間氨基酚不超過(guò)0.25%。

討論 為何選用氫氧化四丁基銨？

課間休息十分鐘

復(fù)習(xí)離子對(duì)色譜法：5min

保留機(jī)制結(jié)合示意圖講解。

請(qǐng)同學(xué)解釋：為何采用ion-pair HPLC法？

5min

提醒學(xué)生：pH值的重要性。此處重點(diǎn)講解。

3min

離子對(duì)試劑濃度變化對(duì)樣品離子保留的影響？

7min

什么是外插參照峰？選擇的原則是什么？

10為mg與μg之間的換算。

5min

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（一)酸堿滴定法

1. 直接滴定法 阿司匹林結(jié)構(gòu)中的游離羧基，可采用堿滴定液直接滴定。各國(guó)藥典測(cè)定雙水楊酯的含量也采用直接滴定法。 

方法：取本品約0.4g，精密稱定，加中性乙醇（對(duì)酚酞指示液顯中性)20ml，溶解后，加酚酞指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L)滴定。每1ml的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L)相當(dāng)于18.02mg的C₉H₈O₄。

討論：（1)為何用中性乙醇為溶劑？---防止阿司匹林酯結(jié)構(gòu)在滴定時(shí)水解，致使測(cè)定結(jié)果偏高，故不用水為溶劑。

（2)為何選用酚酞？--- 強(qiáng)堿滴定弱酸，化學(xué)計(jì)量點(diǎn)偏堿性，故選用堿性區(qū)變色的酚酞。

（3)滴定時(shí)應(yīng)在不斷振搖下稍快地進(jìn)行，以防止局部堿度過(guò)大而促使其水解。

（4)供試品中所含水楊酸超過(guò)規(guī)定限度時(shí)，則不宜用直接滴定法測(cè)定。

2. 水解后剩余滴定法 利用阿司匹林酯結(jié)構(gòu)在堿性溶液中易水解，加入定量過(guò)量的氫氧化鈉滴定液，加熱使酯水解，剩余的堿用酸溶液回滴。

USP(24)方法：取本品約1.5g，精密稱定，加入氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L)50.0ml，混合，緩緩煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/L)滴定剩余的氫氧化鈉，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml的氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L)相當(dāng)于45.04mg的C₉H₈O₄。

討論：空白試驗(yàn)？--堿液在受熱時(shí)很易吸收CO₂，用酸回滴定時(shí)會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，故需在同樣條件下進(jìn)行空白試驗(yàn)校正之。

從反應(yīng)式可知中：硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.25mol/L)與阿司匹林的摩爾比為1：1

講授結(jié)合多媒體教學(xué)以及課堂討論和練習(xí)

請(qǐng)同學(xué)思考并回答：

（1)為何用中性乙醇為溶劑？

（2)為何選用酚酞？

15min

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

3. 兩步滴定法 用于阿司匹林片和阿司匹林腸溶片的含量測(cè)定。片劑中除了加入少量酒石酸或枸櫞酸穩(wěn)定劑外，制劑工藝過(guò)程中又可能有水解產(chǎn)物（水楊酸、醋酸)產(chǎn)生，因此不能采用直接滴定法，而采用先中和與供試品共存的酸，再將阿司匹林在堿性條件下水解后測(cè)定的兩步滴定法。

中和 取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取片粉適量（約相當(dāng)于阿司匹林0.3g)，加入中性乙醇(對(duì)酚酞指示液顯中性)20ml，振搖使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L)至溶液顯粉紅色。此時(shí)中和了存在的游離酸，阿司匹林也同時(shí)成為鈉鹽。

水解與測(cè)定 在中和后的供試品溶液中，加入定量過(guò)量的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L)40 ml，置水浴上加熱15min并時(shí)時(shí)振搖(使酯結(jié)構(gòu)水解)，迅速放冷至室溫，再用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定剩余的堿，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。

含量計(jì)算  供試品中阿司匹林(分子量=180.16)的含量，由水解時(shí)消耗的堿量計(jì)算。

水解與測(cè)定反應(yīng)：

反應(yīng)式中，硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05mol/L)與阿司匹林的摩爾比為0.5:1，

故T=0.05×(1/0.5)×180.16=18.02(mg/ml)

  ASA的標(biāo)示量%＝

20min

1.為何采用兩步滴定法？所謂兩步指的是哪二個(gè)過(guò)程？

2.硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05mol/L)與阿司匹林的摩爾比為多少？

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

式中：V₀為空白試驗(yàn)消耗硫酸滴定液體積（ml)；V為樣品測(cè)定試驗(yàn)消耗硫酸滴定液體積（ml)；F為硫酸滴定液濃度校正因數(shù)；T為滴定度，W為供試品片粉取樣量（g)；為平均片重（g)。

阿司匹林腸溶片的含量測(cè)定亦采用兩步滴定法。

（二)亞硝酸鈉滴定法---對(duì)氨基水楊酸鈉 中國(guó)藥典（2005年版)

（三)高效液相色譜法

為了分離原料藥和制劑中的雜質(zhì)、輔料以及穩(wěn)定劑等，中國(guó)藥典（2005年版)采用高效液相色譜法測(cè)定阿司匹林栓劑；USP(23)用于測(cè)定對(duì)氨基水楊酸鈉及其片劑，阿司匹林片劑，長(zhǎng)效與緩沖片劑，緩釋膠囊等。

（四)柱分配色譜－紫外分光光度法

1. 水楊酸的限量測(cè)定

2. 含量測(cè)定

(五)血清中阿司匹林（ASA)和水楊酸（SA)濃度的HPLC測(cè)定法

中國(guó)藥典（2005年版)采用亞硝酸鈉滴定法測(cè)定含量的藥物有：

對(duì)氨基水楊酸鈉及其制劑對(duì)氨基水楊酸鈉腸溶片、注射用對(duì)氨基水楊酸鈉。

亞硝酸鈉滴定法-此處略講。

5min

何為內(nèi)標(biāo)法？

配合課件演示講解。

此測(cè)定法，請(qǐng)學(xué)生自學(xué)。

問(wèn)題討論(5min)；

作業(yè)和習(xí)題布置2(min)；

歸納總結(jié)(3min)。

小 結(jié)

本節(jié)課主要講授了①藥物的鑒別反應(yīng)，要掌握與鐵鹽反應(yīng)、重疊化-偶合反應(yīng)、水解反應(yīng)、分解產(chǎn)物反應(yīng)及UV、IR；②藥物特殊雜質(zhì)檢查方法，主要掌握阿司匹林中、對(duì)氨基水楊酸鈉中、氯貝丁酯中特殊雜質(zhì)檢查，特別是雙相滴定法及其原理；離子對(duì)色譜法及其原理。

復(fù)習(xí)思考題

或

作 業(yè) 題

1.芳酸及其酯類藥物有哪些鑒別方法？

2.阿司匹林、對(duì)氨基水楊酸鈉中特殊雜質(zhì)各是什么？怎樣檢查？

3.聯(lián)系貝諾酯的鑒別試驗(yàn)，解釋什么是重氮化-偶合反應(yīng)？

4.雙相滴定法及其原理？

5.離子對(duì)色譜法及其原理？

6.在水楊酸與鐵鹽的反應(yīng)中，其適宜的pH值為多少

7.間氨基酚的限量為何采用ion-pair HPLC法？

教 學(xué) 效 果

與 分 析

多媒體教學(xué)和板書相結(jié)合，并結(jié)合一定的實(shí)例，加深學(xué)生對(duì)知識(shí)點(diǎn)的認(rèn)識(shí)和了解。特別是通過(guò)問(wèn)題討論，讓大家對(duì)所學(xué)知識(shí)進(jìn)行回顧、討論，建立一個(gè)互動(dòng)的教學(xué)氛圍。效果較好，為下節(jié)課水楊酸類藥物的繼續(xù)學(xué)習(xí)及其質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)打下基礎(chǔ)。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

第二節(jié) 苯甲酸類藥物的分析

各國(guó)藥典收載的本類藥物有苯甲酸及其鈉鹽(Benzoic Acid and Sodium Benzoate)、布美他尼(Bumetanide)、羥苯乙酯(Ethylparoben)及丙磺舒(Probenecid)等藥物及其制劑。

一、鑒別試驗(yàn)

（一)三氯化鐵反應(yīng)

1. 苯甲酸的堿性水溶液或苯甲酸的中性溶液，與三氯化鐵試液生成堿式苯甲酸鐵鹽的赭色沉淀。

復(fù)習(xí)舊課（2min)；

作業(yè)解析(3min)；

5min

丙磺舒：

對(duì)-[(二丙氨基)磺酰基]苯甲酸。

甲芬那酸：

(2,3-二甲苯基)氨基苯甲酸

5min

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

2.丙磺舒加少量氫氧化鈉試液使生成鈉鹽后，在pH約5.0～6.0水溶液中與三氯化鐵試液反應(yīng)，即產(chǎn)生米黃色沉淀，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式為：

（二)分解產(chǎn)物的反應(yīng)

1. 苯甲酸鹽可分解成苯甲酸升華物，分解產(chǎn)物可用于鑒別。如苯甲酸鈉置干燥試管中，加硫酸后，加熱，不炭化，但析出苯甲酸，在試管內(nèi)壁凝成白色升華物。

2. 含有鹵素或硫的藥物,可分解后鑒別。丙磺舒與氫氧化鈉熔融，分解生成亞硫酸鈉，經(jīng)硝酸氧化成硫酸鹽，而顯硫酸鹽反應(yīng)。

3.丙磺舒

高溫加熱后，能產(chǎn)生二氧化硫氣體，具臭味。

（三)紫外吸收與紅外吸收光譜

利用其最大、最小波長(zhǎng)及吸收系數(shù)進(jìn)行鑒別。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

1.羥苯乙酯中有關(guān)物質(zhì)的檢查

反相薄層色譜法，供試品自身對(duì)照，BP（1998)。

方法：

吸附劑：GF₂₅₄C₁₈化學(xué)鍵合硅膠

展開劑：甲醇-水-冰醋酸（70：30：1)

檢查：取羥苯乙酯丙酮溶液[1.0%①和0.01%②]各2μg點(diǎn)樣，展開后中，揮開溶劑，在254nm紫外燈下檢視。溶液①所得任何第二個(gè)斑點(diǎn)的大不小和強(qiáng)度不應(yīng)超過(guò)溶液②的斑點(diǎn)。

討論：兩類固定相

物理結(jié)合的:

化學(xué)鍵合的：

2.甲芬那酸中特殊雜質(zhì)的檢查

合成工藝

以鄰-氯苯甲酸（o-chlorobenzoic acid)和2,3-二甲基苯胺（2,3-dimethylaniline)為原料，在銅的催化下縮合而成[JP（13)]。

  檢查

1.“銅鹽”檢查法

（1)分光光度法：取本品1.g，加硫酸濕潤(rùn)后，熾灼俟灰化完全后，加0.5mol/L硫酸溶液10ml。放置10min，用水20ml轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗中，加含20%的枸椽酸二銨與5%的乙二胺四醋酸二鈉的混合溶液10ml，

請(qǐng)同學(xué)解釋：

硅膠GF₂₅₄

兩類固定相

5min

“銅鹽”檢查法又稱二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法。為Ch.P(2005)所收載 。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（2).原子吸收分光光度法：BP（1998)規(guī)定原子吸收分光光度法測(cè)定銅含量不得超過(guò)百萬(wàn)分之十。

2.有關(guān)物質(zhì)

（1)檢查方法：薄層色譜法

溶劑：三氯甲烷：甲醇（3：1)

　　　　　　濃度：供試品――25mg/ml

   對(duì)照品――50μg/ml

　　　　　　 點(diǎn)樣量：20μl

　　　　　　展開劑：異丁醇-濃氨溶液（3：1)

薄層板：硅膠GF₂₅₄

    檢測(cè)方法：碘蒸氣中放置5min，置紫外光燈下（254nm)下檢視。

結(jié)果：供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)與對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)比較，不得更深。其限量為0.2%。

JP（13)與上述方法不同之處：

  對(duì)照品――20μg/ml

點(diǎn)樣量：25μl

　限量：0.1%.BP（1998)：

薄層板：硅膠GF₂₅₄

   供試品溶液：0.125g，加甲醇-二氯甲烷（1：3)溶解稀釋至5ml。

　對(duì)照品溶液（a)：取供試品溶液1ml，加甲醇-二氯甲烷（1：3)

混合液稀釋至50ml。取此液1ml，加甲醇-二

氯甲烷（1：3)混合液使溶解并稀釋至10ml，

即得。

　對(duì)照品溶液（b)：取氟芬那酸（flufenamic acid)5mg和甲芬那

酸5mg，加甲醇-二氯甲烷（1：3)混合液使溶解并稀釋至10ml，即得。

　測(cè)定法：供試品溶液和對(duì)照溶液各點(diǎn)樣20μl，于同一薄層板上，

用冰醋酸-二氧六環(huán)-甲苯（1：25：90)混合液為展開

劑展開約15cm，將薄層板置暖氣流中干燥后，再于碘

蒸氣中放置5min，在紫外燈（254nm)下檢測(cè)。供試液

色譜圖中，除主斑點(diǎn)外，任何斑點(diǎn)不得比對(duì)照溶液（a)

的斑點(diǎn)深（0.2%)。本試驗(yàn)必須在對(duì)照溶液（b)顯示兩

個(gè)清晰的分離斑點(diǎn)時(shí)方有效，否則無(wú)否。

5min

此處提示同學(xué)注意：不同國(guó)家藥典對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查的異同。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（2)討論：

①各國(guó)藥典采用的薄層色譜法，均是利用供試品自身高低濃度對(duì)照法進(jìn)行檢查的。

②有關(guān)物質(zhì)。

三、含量測(cè)定

（一)酸堿滴定法

1. 直接滴定法---苯甲酸、丙磺舒、甲芬那酸[Ch.P(2005)]。

2. 水解后剩余滴定法 羥苯乙酯具有羧酸酯，利用此結(jié)構(gòu)在堿性溶液中水解的性質(zhì)，加入定量過(guò)量的氫氧化鈉滴定液，回流使酯水解，剩余的堿以酸回滴定，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)校正。 

  （二)雙相滴定法

利用苯甲酸能溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，在水相中加入與水不相混溶的有機(jī)溶劑，并置于分液漏斗中進(jìn)行滴定反應(yīng)，將滴定過(guò)程中產(chǎn)生的苯甲酸不斷萃取入有機(jī)溶劑層中，減少苯甲酸在水中的濃度，使滴定反應(yīng)完全，終點(diǎn)清晰，同時(shí)可降低苯甲酸的離解。

方法：取本品1.5g，精密稱定，置分液漏斗中，加水25ml、乙醚50ml及甲基橙指示液2滴，用鹽酸滴定液（0.5mol/L)滴定，隨滴隨振搖，至水層顯橙紅色，分取水層，置具塞錐形瓶中，乙醚層用水5ml洗滌，洗液并入錐形瓶中，加乙醚20ml，繼續(xù)用鹽酸滴定液(0.5mol/L)滴定，隨滴定隨振搖，至水層顯持續(xù)的橙紅色。每1ml的鹽酸滴定液（0.5mol/L)相當(dāng)于72.06mg的C₇H₅NaO₂。

5min

^酚磺酞的變色范圍  pH6.8～8.4（黃→紅)

酚酞的變色范圍  pH8.3～10.0（無(wú)色→紅)。

10min

10min

有機(jī)相

界面

水相

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（四)高效液相色譜法---丙磺舒原料藥USP(23)

（五)尿中丙磺舒的固相萃取凈化－高效液相色譜分析法

生物體液中丙磺舒及其制劑的含量測(cè)定，常采用HPLC法。但生物樣本凈化若應(yīng)用液－液萃取，需要多次提取操作，分析時(shí)間長(zhǎng)。高效液相色譜分析中，大多在流動(dòng)相中利用離子對(duì)試劑或磷酸鹽緩沖劑。而要獲得重現(xiàn)性好的結(jié)果，一定要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，特別是pH值、離子強(qiáng)度和溫度。另一方面，因?yàn)楸�磺舒色譜峰不對(duì)稱且靈敏度低，樣品測(cè)定檢測(cè)限為0.25g/ml～10g/ml。這樣，不能檢測(cè)服藥24h后的藥物濃度。

為了評(píng)價(jià)尿樣中丙磺舒對(duì)運(yùn)動(dòng)員違禁藥物尿排泄的作用，可采用固相萃取凈化－高效液相色譜法進(jìn)行快速、靈敏的測(cè)定。

色譜條件

對(duì)照品溶液的制備

尿樣的處理 C₈固相萃取柱，100mg填料/ml用甲醇1.0ml，然后用0.5ml蒸餾水使活化。內(nèi)標(biāo)物甲醇溶液（10μg/ml)300μl加入2.0ml尿中，樣品通過(guò)柱子后，用蒸餾水1.0ml洗去生物基質(zhì)。再用甲醇0.5ml洗脫柱子，所得藥物和內(nèi)標(biāo)物的洗脫液經(jīng)0.45μ m濾膜濾過(guò)，取5μl進(jìn)樣分析，得色譜圖（圖6-4)。

此處略講，以學(xué)生自學(xué)為主。

結(jié)合尿中丙磺舒的固相萃取凈化－高效液相色譜分析法講解什么是內(nèi)標(biāo)物？其基本要求是什么？

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

人尿樣品測(cè)定

第三節(jié) 其他芳酸類藥物的分析

一、典型藥物的結(jié)構(gòu)

氯貝丁酯(Clofibrate)： 2-甲基-2-(4-氯苯氧基)丙酸乙酯，又稱安妥明或氯苯丁酯。

二、鑒別試驗(yàn)

1. 三氯化鐵反應(yīng)  

布洛芬

其無(wú)水乙醇溶液，加入高氯酸羥胺-無(wú)水乙醇試液及N，N’-雙環(huán)己基酸二亞胺（DCC)-無(wú)水乙醇試液，混合后，在溫水中加熱20min。冷卻后中，加高氯酸鐵-無(wú)水乙醇液，即呈紫色［JP(14)的方法］�！吨袊�(guó)藥典》采用紫外的最大、最小吸收及紅外光譜進(jìn)行鑒別。

2. 重氮化－偶合反應(yīng)

甲芬那酸

甲芬那酸的甲醇溶液，與對(duì)-硝基苯重氮鹽試液在氫氧化鈉堿性條件下偶合產(chǎn)生橙紅色[JP（13)的方法]。

3．氧化反應(yīng)

4．UV、IR

3min

氯貝丁酯：

2-甲基-2-(4-氯苯氧基)丙酸乙酯，又稱安妥明或氯苯丁酯。

布洛芬：

2-(4-異丁基苯基)丙酸

2min,重點(diǎn)講解三氯化鐵反應(yīng)和重氮化反應(yīng)。

此法為

JP(14)的方法

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

三、特殊雜質(zhì)檢查

氯貝丁酯中特殊雜質(zhì)的檢查

（一)合成工藝

氯貝丁酯的合成是以對(duì)氯酚為起始原料，生產(chǎn)過(guò)程中的主要中間體為對(duì)氯苯異丁酸。合成工藝如下：

  對(duì)氯酚為氯貝丁酯合成的起始原料，同時(shí)，氯貝丁酯由于分解也能產(chǎn)生對(duì)氯酚，故在成品中常有微量存在。因其毒性大，各國(guó)藥典均檢查對(duì)氯酚。

（二)對(duì)氯酚的檢查方法

1.氣相色譜法

色譜條件：

對(duì)照品溶液：

供試品溶液：

測(cè)定法：

討論：

2.高效液相色譜法[JP（13)的方法]

色譜條件：

內(nèi)標(biāo)溶液：

供試品溶液：

對(duì)照品溶液：

測(cè)定法：

5min

來(lái)源：原料及產(chǎn)品分解

5min

因供試品是經(jīng)處理后才上柱的，此時(shí)已不含氯貝丁酯，因此書上的解釋有不妥之處。對(duì)

以上作解釋。

JP(13)采用的是氰基柱，適合分離極性化合物，尤其是在硅膠柱上峰形不對(duì)稱化合物的分析。一般為正相色譜。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

采用氣相色譜法檢查合成過(guò)程中試劑等揮發(fā)性雜質(zhì)的檢查。

色譜條件：

預(yù)試溶液：

供試品溶液：

四、含量測(cè)定

1.氯貝丁酯（P130)：兩步滴定法ChP（2005)

兩步滴定法 為了消除供試品中共存的酸性雜質(zhì)，在加熱水解前，滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L)中和溶液至中性（對(duì)酚酞指示液顯中性)。然后加入定量過(guò)量的氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L)，加熱回流水解，生成對(duì)氯苯氧異丁酸鈉和乙醇，剩余的氫氧化鈉用鹽酸滴定液（0.5mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，測(cè)得藥物的含量。

方法 取氯丁貝酯2g，精密稱定，置錐形瓶中，加中性乙醇（對(duì)酚酞指示液顯中性)10ml與酚酞指示液數(shù)滴，滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L)至顯粉紅色，再精密加氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L)20ml，加熱回流1小時(shí)至油珠完全消失，放冷，用新沸過(guò)的冷水洗滌冷凝管，洗液并入錐形瓶中，加酚酞指示液數(shù)滴，用鹽酸滴定液（0.5mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 ml的氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L)相當(dāng)于121.4mg的C₁₂H₁₅ClO₃。 

2. 氯貝丁酯（P131)：離子交換后紫外分光光度法USP(23)

氯貝丁酯和對(duì)氯酚等雜質(zhì)均具有紫外吸收，因此需采用強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂吸附酸性雜質(zhì)后，方可定量測(cè)定氯貝丁酯的含量。

離子交換樹脂的預(yù)處理：

離子交換柱的制備：　

測(cè)定法：　　  

此處略解，由學(xué)生自學(xué)為主。

15min，重點(diǎn)講解兩步滴定法

問(wèn)題討論(15min)；

作業(yè)和習(xí)題布置(2min)；

歸納總結(jié)(3min)。

小 結(jié)

本次課講授的主要內(nèi)容為鑒別試驗(yàn)，要掌握與鐵鹽反應(yīng)、重疊化-偶合反應(yīng)、水解反應(yīng)、分解產(chǎn)物反應(yīng)及UV、IR；特殊雜質(zhì)檢查，應(yīng)掌握對(duì)氨基水楊酸鈉中、氯貝丁酯中特殊雜質(zhì)檢查；含量測(cè)定，應(yīng)掌握水解后剩余滴定法、兩步滴定法、雙相滴定法在含量測(cè)定中的應(yīng)用。

復(fù)習(xí)思考題

或

作 業(yè) 題

1. 為何采用兩步滴定法測(cè)定阿司匹林的含量？所謂兩步指的是哪二個(gè)過(guò)程？

2.在阿司匹林含量測(cè)定的兩步滴定法中，為什么酚羥基沒有成鈉鹽？

3. 在阿司匹林含量測(cè)定的兩步滴定法中，為什么選用中性乙醇？

4.在水楊酸與鐵鹽的反應(yīng)中，其適宜的pH值為多少？聯(lián)系此點(diǎn)解釋USP(24)采用柱分配色譜-紫外法測(cè)定阿司匹林制劑的含量及其水楊酸限量檢查的原理。

教 學(xué) 效 果

與 分 析

多媒體教學(xué)和板書相結(jié)合，并結(jié)合一定的實(shí)例，加深學(xué)生對(duì)知識(shí)點(diǎn)的認(rèn)識(shí)和了解。特別是通過(guò)問(wèn)題討論，讓大家對(duì)所學(xué)知識(shí)進(jìn)行回顧、討論，建立一個(gè)互動(dòng)的教學(xué)氛圍。效果較好。