細(xì)菌(bacterium)是屬原核生物界(prokaryotae)的一種單細(xì)胞微生物,有廣義和狹義兩種范疇。廣義上泛指各類原核細(xì)胞型微生物,包括細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體。狹義上則專指其中數(shù)量最大、種類最多、具有典型代表性的細(xì)菌,是本章討論的對象。它們形體微小,結(jié)構(gòu)簡單,具有細(xì)胞壁和原始核質(zhì),無核仁和核膜,除核糖體外無其他細(xì)胞器。
了解細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)對研究細(xì)菌的生理活動、致病性和免疫性,以及鑒別細(xì)菌、診斷疾病和防治細(xì)菌性感染等均有重要的理論和實際意義。
第一節(jié) 細(xì)菌的大小與形態(tài)
觀察細(xì)菌最常用的儀器是光學(xué)顯微鏡,其大小可以用測微尺在顯微鏡下進行測量,一般以微米(μm)為單位。不同種類的細(xì)菌大小不一,同一種細(xì)菌也因菌齡和環(huán)境因素的影響而有差異。
細(xì)菌按其外形,主要有球菌、桿菌和螺形菌三大類。
球菌 多數(shù)球菌(coccus)直徑在1μm左右,外觀呈圓球形或近似球形。由于繁殖時細(xì)菌分裂平面不同和分裂后菌體之間相互粘附程度不一,可形成不同的排列方式,這對一些球菌的鑒別頗有意義。
1.雙球菌(diplococcus) 在一個平面上分裂,分裂后兩個菌體成對排列,如腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌。
2.鏈球菌(streptococcus) 在一個平面上分裂,分裂后多個菌體粘連成鏈狀,如乙型溶血性鏈球菌。
3.葡萄球菌(staphylococcus) 在多個不規(guī)則的平面上分裂,分裂后菌體無一定規(guī)則地粘連在一起似葡萄狀,如金黃色葡萄球菌。
4.四聯(lián)球菌(tetrads) 在兩個互相垂直的平面上分裂, 分裂后四個菌體粘附在一起呈正方形,如 四聯(lián)加夫基菌。
5.八疊球菌(sarcina) 在三個互相垂直的平面上分裂,分裂后八個菌體粘附成包裹狀立方體, 如藤黃八疊球菌
各類球菌在標(biāo)本或培養(yǎng)物中除上述的典型排列方式外,還可有分散的單個菌體存在。
桿菌 不同桿 菌(bacillus)的大小、長短、粗細(xì)很不一致。 大的桿菌如炭疽芽胞桿菌長3~10μm,中等的如大腸埃希菌長2-3μm,小的如布魯菌長僅 0.6-1.5μm。
桿菌形態(tài)多數(shù)呈直桿狀,也有的菌體稍彎;多數(shù)呈分散存在,也有的呈鏈狀排列,稱為鏈桿菌(streptobacillus);菌體兩端大多呈鈍圓形,少數(shù)兩端平齊(如炭疽芽胞桿菌)或兩端尖細(xì)(如梭桿菌)。有的桿菌末端膨大成棒狀,稱為棒狀桿菌(corynebacterium);有的菌體短小,近于橢圓形,稱為球桿菌(coccobacillus);有的常呈分支生長趨勢,稱為分枝桿菌(mycobacterium);有的末端常呈分叉狀,稱為雙歧桿菌(bifidobacterium)。
螺形菌 螺形菌(spiral bacterium)菌體彎曲,有的菌體長2-3μm,只有一個彎曲,呈弧形或逗點狀稱為弧菌(vibrio), 如霍亂弧菌;有的菌體長3~6μm,有數(shù)個彎曲稱為螺菌(spirillum), 如鼠咬熱螺菌;也有的菌體細(xì)長彎曲呈弧形或螺旋形,稱為螺桿菌(helicobacterium),如幽門螺桿菌。
細(xì)菌的形態(tài)受溫度、pH 、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時間等因素影響很大。一般是細(xì)菌在適宜的生長條件下培養(yǎng)8-18d時形態(tài)比較典型, 在不利環(huán)境或菌齡老時常出現(xiàn)梨形、氣球狀和絲狀等不規(guī)則的多形性(polymorphism),稱為衰退型(involution form)。因此,觀察細(xì)菌的大小和形態(tài),應(yīng)選擇適宜生長條件下的對數(shù)期為宜。
第二節(jié) 細(xì)菌的結(jié)構(gòu)
細(xì)菌雖小,仍具有一定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)等各種細(xì)菌都有,是細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu);莢膜、鞭毛、菌毛、芽胞僅某些細(xì)菌具有,為其特殊結(jié)構(gòu)。
一、細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)
細(xì)胞壁 細(xì)胞壁(cell wall)位于菌細(xì)胞的最外層,包繞在細(xì)胞膜的周圍。是一種膜狀結(jié)構(gòu),組成較復(fù)雜, 并隨不同細(xì)菌而異。 用革蘭染色法可將細(xì)菌分為兩大類,即革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的共有組分為肽聚糖,但各自有其特殊組分。
1.肽聚糖(peptidoglycan)
肽聚糖是一類復(fù)雜的多聚體,是細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要組分,為原核細(xì)胞所特有,又稱為粘肽(mucopeptide)、糖肽(glycopeptide)或胞壁質(zhì)(murein)。革蘭陽性菌的肽聚糖由聚糖骨架、四肽側(cè)鏈和五肽交聯(lián)橋三部分組成(圖1-3),革蘭陰性菌的肽聚糖僅由聚糖骨架和四肽側(cè)鏈兩部分組成(圖1-4)。
2.革蘭陽性菌細(xì)胞壁特殊組分
革蘭陽性菌的細(xì)胞壁較厚(20~80nm),除含有15~50層肽聚糖結(jié)構(gòu)外,大多數(shù)尚含有大量的磷壁酸(teichoic acid),少數(shù)是磷壁醛酸(teichuroic acid),約占細(xì)胞壁干重的50%(圖1-5)。
此外,某些革蘭陽性菌細(xì)胞壁表面尚有一些特殊的表面蛋白質(zhì),如金黃色葡萄球菌的A蛋白, A群鏈球菌的M蛋白等。
3.革蘭陰性菌細(xì)胞壁特殊組分 革蘭陰性菌細(xì)胞壁較。10~15nm),但結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。除含有1~2層的肽聚糖結(jié)構(gòu)外,尚有其特殊組分外膜(outer membrane),約占細(xì)胞壁干重的80%(圖1-6)。
外膜由脂蛋白、脂質(zhì)雙層和脂多糖三部分組成。
革蘭陽性和陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)顯著不同,導(dǎo)致這兩類細(xì)菌在染色性、抗原性、致病性及對藥物的敏感性等方面的很大差異。
4.細(xì)胞壁的功能
細(xì)菌細(xì)胞壁堅韌而富彈性,其主要功能維持菌體固有的形態(tài),并保護細(xì)菌抵抗低滲環(huán)境。細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有高濃度的無機鹽和大分子營養(yǎng)物質(zhì),其滲透壓高達(dá)5~25個大氣壓。由于細(xì)胞壁的保護作用,使細(xì)菌能承受內(nèi)部巨大的滲透壓而不會破裂,并能在相對低滲的環(huán)境下生存。細(xì)胞壁上有許多小孔,參與菌體內(nèi)外的物質(zhì)交換。菌體表面帶有多種抗原表位,可以誘發(fā)機體的免疫應(yīng)答。
5.細(xì)菌細(xì)胞壁缺陷型(細(xì)菌L型)
細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)受到理化或生物因素的直接破壞或合成被抑制,這種細(xì)胞壁受損的細(xì)菌一般在普通環(huán)境中不能耐受菌體內(nèi)的高滲透壓而將會脹裂死亡。但在高滲環(huán)境下,它們?nèi)钥纱婊睢8锾m陽性菌細(xì)胞壁缺失后, 原生質(zhì)僅被一層細(xì)胞膜包住,稱為原生質(zhì)體(protoplast);革蘭陰性菌肽聚糖層受損后尚有外膜保護,稱為原生質(zhì)球(spheroplast)。這種細(xì)胞壁受損的細(xì)菌能夠生長和分裂者稱為細(xì)菌細(xì)胞壁缺陷型或L型(bacterial L form), 因1935年klieneberger首先在Lister研究院發(fā)現(xiàn)而得名。
細(xì)胞膜 細(xì)胞膜(cell membrane)或稱胞質(zhì)膜(cytoplasmic membrane),位于細(xì)胞壁內(nèi)側(cè),緊包著細(xì)胞質(zhì)。厚約7.5nm,柔韌致密,富有彈性,占細(xì)胞干重的10%~30%。細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞者基本相同,由磷脂和多種蛋白質(zhì)組成,但不含膽固醇。
細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞膜包裹的溶膠狀物質(zhì)為細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)或稱原生質(zhì)(protoplasm),由水、蛋白質(zhì)、脂類、核酸及少量糖和無機鹽組成,其中含有許多重要結(jié)構(gòu)。
核質(zhì) 細(xì)菌是原核細(xì)胞,不具成形的核。細(xì)菌的遺傳物質(zhì)稱為核質(zhì)(nuclear material)或擬核(nucleoid),集中于細(xì)胞質(zhì)的某一區(qū)域,多在菌體中央,無核膜、核仁和有絲分裂器;因其功能與真核細(xì)胞的染色體相似,故習(xí)慣上亦稱之為細(xì)菌的染色體(chromosome)。
二、細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)
莢膜 某些細(xì)菌在其細(xì)胞壁外包繞一層粘液性物質(zhì),為疏水性多糖或蛋白質(zhì)的多聚體,用理化方法去除后并不影響菌細(xì)胞的生命活動。凡粘液性物質(zhì)牢固地與細(xì)胞壁結(jié)合,厚度≥0.2μm ,邊界明顯者稱為莢膜(capsule)或大莢膜(macrocapsule)(圖1-10)。厚度<0.2μm者稱為微莢膜(microcapsule),傷寒沙門菌的Vi抗原,以及大腸埃希菌的K抗原等屬之。若粘液性物質(zhì)疏松地附著于菌細(xì)胞表面,邊界不明顯且易被洗脫者稱為粘液層(slime layer)。介于莢膜和粘液層之間的結(jié)構(gòu)稱為糖萼(glycocalyx),由多糖或糖蛋白組成,是從菌體伸出的疏松纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
鞭毛 許多細(xì)菌,包括所有的弧菌和螺菌,約半數(shù)的桿菌和個別球菌,在菌體上附有細(xì)長并呈波狀彎曲的絲狀物,少僅1~2根,多者達(dá)數(shù)百。這些絲狀物稱為鞭毛(flagellum),是細(xì)菌的運動器官。鞭毛長5~20μm,直徑12~30nm,需用電子顯微鏡觀察(圖1-11),或經(jīng)特殊染色法使鞭毛增粗后才能在普通光學(xué)顯微鏡下看到(圖1-12)。
菌毛 許多革蘭陰性菌和少數(shù)革蘭陽性菌菌體表面存在著一種比鞭毛更細(xì)、更短而直硬的絲狀物,與細(xì)菌的運動無關(guān),稱為菌毛(pilus或fimbriae)。菌毛由結(jié)構(gòu)蛋白亞單位菌毛蛋白(pilin)組成,呈螺旋狀排列成圓柱體,新形成的菌毛蛋白分子插入菌毛的基底部。菌毛蛋白具有抗原性,其編碼基因位于細(xì)菌的染色體或質(zhì)粒上。菌毛在普通光學(xué)顯微鏡下看不到,必須用電子顯微鏡觀察(圖1-15)。根據(jù)功能不同,菌毛可分為普通菌毛和性菌毛兩類。
芽胞 某些細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下,能在菌體內(nèi)部形成一個圓形或卵圓形小體,是細(xì)菌的休眠形式,稱為內(nèi)芽胞(endospore),簡稱芽胞(spore),以別于真菌在菌體外部形成的孢子。產(chǎn)生芽胞的細(xì)菌都是革蘭陽性菌,重要的有芽胞桿菌屬(炭疽芽胞桿菌等)和梭菌屬(破傷風(fēng)梭菌等)。
第三節(jié) 細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查法
一、顯微鏡放大法
細(xì)菌形體微小,肉眼不能直接看到,必須藉助顯微鏡放大后才能看到。
普通光學(xué)顯微鏡 普通光學(xué)顯微鏡(light microscope)以可見光(日光或燈光)為光源,波長0.4~0.7μm,平均約0.5μm。其分辨率為光波波長的一半,即0.25μm。0.25μm的微粒經(jīng)油鏡放大1000倍后成 0.25mm,人的眼睛便能看清。一般細(xì)菌都大于0.25μm,故可用普通光學(xué)顯微鏡予以觀察。
電子顯微鏡 電子顯微鏡(electron microscope)是利用電子流代替可見光波,以電磁圈代替放大透鏡。電子波長極短,約為0.005nm,其放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)十萬倍,能分辨1nm 的微粒。不僅能看清細(xì)菌的外形,內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)也可一覽無遺。電子顯微鏡顯示的形象,可投射到熒光屏上,也可照像拍攝。當(dāng)前使用的電子顯微鏡有兩類,即透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)。SEM的分辨率一般較TEM低,但可清楚地顯露觀察物體的三維立體圖像。配合電子顯微鏡觀察使用的標(biāo)本制備方法有用磷鎢酸或鉬酸銨作負(fù)染色、投影法(shadowing)、超薄切片(ultrathin section)、冰凍蝕刻法(freeze etching)等。電子顯微鏡標(biāo)本須在真空干燥的狀態(tài)下檢查,故不能觀察活的微生物。
此外,尚有暗視野顯微鏡(darkfield microscope)、相差顯微鏡(phase contrast microscope)、熒光顯微鏡(fluorescence microscope)和同焦點顯微鏡(cofocal microscope)等,適用于觀察不同情況下的細(xì)菌形態(tài)和(或)結(jié)構(gòu)。
二、染色法
細(xì)菌體小半透明,經(jīng)染色后才能觀察較清楚。染色法是染色劑與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的醫(yī)學(xué)檢驗網(wǎng)結(jié)合。最常用的染色劑是鹽類。 其中,堿性染色劑(basic stain)由有色的陽離子和無色的陰離子組成,酸性染色劑(acidic stain)則相反。菌細(xì)胞富含核酸,可以與帶正電荷的堿性染色劑結(jié)合;酸性染色劑不能使細(xì)菌著色,而使背景著色形成反差,故稱為負(fù)染(negative staining)。
染色法有多種,最常用最重要的分類鑒別染色法是革蘭染色法(Gram stain)。該法是丹麥細(xì)菌學(xué)家革蘭(Hans Christian Gram)于1884年創(chuàng)建,至今仍在廣泛應(yīng)用。標(biāo)本固定后,先用堿性染料結(jié)晶紫初染,再加碘液媒染,使之生成結(jié)晶紫—碘復(fù)合物;此時不同細(xì)菌均被染成深紫色。然后用95%乙醇處理,有些細(xì)菌被脫色,有些不能。最后用稀釋復(fù)紅或沙黃復(fù)染。此法可將細(xì)菌分為兩大類:不被乙醇脫色仍保留紫色者為革蘭陽性菌,被乙醇脫色后復(fù)染成紅色者為革蘭陰性菌。革蘭染色法在鑒別細(xì)菌、選擇抗菌藥物、研究細(xì)菌致病性等方面都具有極其重要的意義。
革蘭染色法的原理尚未完全闡明。但與菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)密切相關(guān),如果在結(jié)晶紫—碘染之后,乙醇脫色之前去除革蘭陽性菌的細(xì)胞壁,革蘭陽性菌細(xì)胞就能夠被脫色。目前,對革蘭陽性和革蘭陰性菌細(xì)胞壁的化學(xué)組分已十分清楚,但對革蘭陽性菌細(xì)胞壁阻止染料被溶出的原因尚不清楚。
細(xì)菌染色法中尚有單染色法、抗酸染色法、以及莢膜、芽胞、鞭毛、細(xì)胞壁、核質(zhì)等特殊染色法。