免疫學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)習(xí)指導(dǎo)

河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

免疫學(xué)教研室

二零零五年七月

實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

一、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室要穿白大衣，必要時(shí)要戴帽子和口罩。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后要按規(guī)定位置就座，實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行時(shí)，不準(zhǔn)隨意出進(jìn)。

   二、要保持實(shí)驗(yàn)室安靜。實(shí)驗(yàn)室絕對(duì)禁止飲食、吸煙、用嘴濕潤(rùn)鉛筆和標(biāo)簽等。實(shí)驗(yàn)材料、動(dòng)物等均需按規(guī)定處理，不要亂動(dòng)亂放，未經(jīng)許可，不得將實(shí)驗(yàn)室的物品攜帶出室外。

   三、實(shí)驗(yàn)室用的玻璃器材，如玻片、試管等，根據(jù)試驗(yàn)要求，用前需用蠟筆馬上標(biāo)記，如實(shí)驗(yàn)日期、組別、姓名等，以免混淆。

   四、注意防火�；鹪床灰�接近易燃物品（如棉塞、酒精、二甲苯等)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)檢查門(mén)、窗、水、電、火、防止發(fā)生事故。特別是實(shí)驗(yàn)材料，一律不準(zhǔn)帶出室外，以防意外，使用實(shí)驗(yàn)器材、藥品要愛(ài)護(hù)，并注意節(jié)約。

   五、實(shí)驗(yàn)完畢，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)，將臺(tái)面器材、物品放回原處，用肥皂洗手后，再離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)課學(xué)期總成績(jī):20分，其中：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告——5分

平時(shí)成績(jī)——10分

期末考試——5分

各項(xiàng)判斷標(biāo)準(zhǔn)：

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

內(nèi)容（原理、步驟、結(jié)果、討論)——4分

書(shū)寫(xiě)（認(rèn)真、詳細(xì))——1分

2、平時(shí)成績(jī)

以10分為基準(zhǔn)點(diǎn)，包括實(shí)驗(yàn)完成情況（課堂提問(wèn)、動(dòng)手操作、實(shí)驗(yàn)態(tài)度)、課堂紀(jì)律（著裝、遲到、早退、曠課)以及值日生表現(xiàn)等方面。

加分：

☆班長(zhǎng)—— ＋0～1

√志愿者—— ＋1～2

扣分：

□上課沒(méi)穿白大衣—— -1

○未按要求完成值日任務(wù)—— -1

×遲到或早退1次—— -1

△未按時(shí)交實(shí)驗(yàn)報(bào)告—— -1（如為抄襲，雙方均 -1分)

？曠課1次（無(wú)班主任或醫(yī)生的證明)—— -2；

曠課3次或3次以上本學(xué)期試驗(yàn)課記為0分。

3、期末考試

以試卷實(shí)際成績(jī)?yōu)闇?zhǔn)。

備注： （1)總分以20為限，超出不再累計(jì)；

（2)如有特殊情況，須請(qǐng)示主任及實(shí)驗(yàn)負(fù)責(zé)老師后，方可酌情處理。

備注：任課老師在免疫實(shí)驗(yàn)課評(píng)分中可參考以上評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)靈活應(yīng)用，實(shí)事求是的打分！

實(shí)驗(yàn)一 凝集反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

一、ABO血型的測(cè)定（直接凝集玻片法)

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解ABO血型鑒定的原理；掌握玻片凝集試驗(yàn)的方法。

（二)實(shí)驗(yàn)原理  已發(fā)現(xiàn)人類紅細(xì)胞有20多種血型系統(tǒng)，其中ABO血型系統(tǒng)在輸血中最為重要，必須血型相合才能輸血。血型鑒定是根據(jù)人類紅細(xì)胞表面有不同的血型抗原，故用已知的抗A、抗B單克隆抗體作直接玻片凝集試驗(yàn)，可測(cè)定血型。

（三)實(shí)驗(yàn)材料 

1、診斷用抗A及抗B單克隆抗體試劑各一支。

2、玻片、無(wú)菌刺血針、消毒用碘酒、酒精、無(wú)菌棉簽、牙簽，記號(hào)筆等

（四)實(shí)驗(yàn)方法

1、取潔凈玻片一張用蠟筆分成兩半，分別標(biāo)記A、B，然后A側(cè)滴一滴抗A抗體（藍(lán)色)，B側(cè)滴一滴抗B抗體（黃色)

2、被檢者耳垂或手指用碘酒消毒，酒精脫碘并涼干后，用刺血針刺血。

3、用牙簽刮取兩滴血液充分與兩種抗體混勻，即可觀察結(jié)果

（五)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

血 型 鑒 定 結(jié) 果

（六)注意事項(xiàng)

1、A、B兩側(cè)不能混，否則結(jié)果不可靠。

2、無(wú)菌觀念：消毒按一定方向，以一點(diǎn)為中心，由內(nèi)向外；注意酒精脫碘，否則損傷皮膚、色素沉著；酒精脫碘后，要晾干，否則進(jìn)針會(huì)有燒灼疼痛；

二、試管直接凝集（直接凝集試管法)

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp; 了解試管凝集的反應(yīng)；掌握倍比稀釋的方法和血清凝集效價(jià)的定義。

（二)實(shí)驗(yàn)原理  試管法是一種定量試驗(yàn)的經(jīng)典方法�？捎靡阎�抗原來(lái)檢測(cè)受檢血清中有無(wú)某抗體及抗體的含量。用來(lái)協(xié)助臨床診斷或供流行病學(xué)調(diào)查研究。用已知的定量抗原與一系列倍比稀釋的待檢血清，在試管內(nèi)混合，經(jīng)一定的時(shí)間保溫靜止后，出現(xiàn)凝集，通過(guò)觀察各管的凝集程度，可定量檢測(cè)血清中的抗體水平。通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)，亦稱為滴度

（三)實(shí)驗(yàn)材料 

1、抗原：滅活傷寒桿菌“H”菌液一管

2、抗體：傷寒桿菌H免疫學(xué)清

3、生理鹽水

4、試管、吸管、試管架、水浴箱等

（四)實(shí)驗(yàn)方法

1、取試管7支，編號(hào)1-7,每加生理鹽水0.5ml。

2、于第一管中加入傷寒桿菌免疫學(xué)清0.5ml，吹吸混勻6次；取出0.5ml加入第二管，吹吸混勻6次；再取0.5ml加入第三管，依次類推至第六管，吸出0.5ml棄之。第七管不加血清，作為對(duì)照。

3、各管分別加入傷寒桿菌“H”菌液0.5ml，震蕩混勻。

4、置50℃水浴箱溫育2小時(shí)，輕輕取出試管，觀察結(jié)果。

（五)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、++++：細(xì)菌全部凝集，凝集塊完全沉于管底，液體清晰透亮。

2、+++：細(xì)菌大部分凝集，凝集塊沉于管底，液體稍渾濁。

3、++：細(xì)菌部分凝集，管底凝集物較前兩者少，仍明顯，液體半澄清。

4、+：液體渾濁，液體中可見(jiàn)非常小的凝集物，須仔細(xì)觀察才能發(fā)現(xiàn)。

5、—：無(wú)凝集物，液體渾濁度與對(duì)照管相同。

（六)注意事項(xiàng)

1、取樣加樣準(zhǔn)確。

2、控制溫度，過(guò)高（超過(guò)55℃)，可導(dǎo)致抗體的破壞。

3、由水浴箱取出試管時(shí)，勿震動(dòng)，避免凝集物懸起，影響結(jié)果的觀察。

4、觀察結(jié)果要與對(duì)照管比較后判斷，避免凝集是因?yàn)樽阅龑?dǎo)致的。

三、間接凝集抑制實(shí)驗(yàn)（妊娠診斷實(shí)驗(yàn))

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp; 掌握間接凝集抑制實(shí)驗(yàn)的原理及方法；掌握妊娠診斷實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程

（二)實(shí)驗(yàn)原理  將可溶性抗原或相應(yīng)抗體預(yù)先混合作用后, 再加入該抗原致敏的載體顆

粒，由于抗體已被可溶性抗原結(jié)合,阻斷了抗體與載體上的抗原作用,不再出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,稱

為間接凝集抑制試驗(yàn)。孕婦末次月經(jīng)后40-90天左右尿液中（人絨毛膜促性腺激素)含量增

高，若將一滴孕尿，加一滴抗血清（HCG免疫家兔獲得)，充分反應(yīng)后，再加一滴乳膠抗原，

不出現(xiàn)凝集顆粒，為妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性，反之，則為陰性。

（三)實(shí)驗(yàn)材料

1、孕婦尿液、正常尿液

2、膠乳抗原、抗血清（兔抗人HCG的抗體)

3、玻片、牙簽、滴管

（四)實(shí)驗(yàn)方法

1、取一張玻片，用蠟筆分成兩半，標(biāo)記“+”，“-”。

2、“+”側(cè)加一滴孕尿，“—”側(cè)加一滴生理鹽水（作為對(duì)照)。

3、兩側(cè)各加一滴抗血清（抗HCG)，輕輕晃動(dòng)玻片0.5-1min。

4、兩側(cè)再加一滴膠乳抗原，分別混勻，放置5min，強(qiáng)光下觀察結(jié)果。

（五)結(jié)果觀察

1、“+”側(cè)呈均勻渾濁乳液，為妊娠實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；

2、“-” 側(cè)出現(xiàn)均勻一致的白色細(xì)沙樣顆粒，為妊娠實(shí)驗(yàn)陰性

（六)注意事項(xiàng)

1、膠乳抗原使用前應(yīng)混勻。

2、加入的尿標(biāo)本、抗血清和膠乳抗原每滴大小一致。

3、加入抗血清后，充分混勻使可溶性抗原與抗體充分反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)二 沉淀反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

一、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(ring precipitation test)：即沉淀反應(yīng)的試管法。

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私猸h(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)的原理及用途；了解簡(jiǎn)單快速測(cè)定微量抗原的方法

（二)實(shí)驗(yàn)原理：在小口徑（直徑小于0.5cm)試管內(nèi)（現(xiàn)用環(huán)沉管)先加入未稀釋的已知抗血清，再小心加入稀釋的可溶性待檢抗原于血清層上面，使之成為分界清晰的兩層，陽(yáng)性者，數(shù)分鐘后在抗原與抗體相遇界面處出現(xiàn)白色沉淀環(huán)，此實(shí)驗(yàn)稱為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)。

應(yīng)用：常用于鑒定微量抗原，如法醫(yī)學(xué)鑒定血跡；細(xì)菌分型等。特點(diǎn)：此法簡(jiǎn)便易行，需用材料較多（用抗體較多，且應(yīng)用效價(jià)較高的抗體)是其缺點(diǎn)。

（三)實(shí)驗(yàn)材料

1、抗原：綿羊血清、豚鼠血清

2、抗體：抗綿羊血清

3、生理鹽水、環(huán)沉管、環(huán)沉管架、毛細(xì)滴管

（四)實(shí)驗(yàn)方法

1、用毛細(xì)滴管在3支沉淀管中加抗體（0.2ML抗綿羊血清)。

2、毛細(xì)滴管分別加1：40、1：320稀釋的抗原、NS，沿管壁緩緩加入，使成明顯界面。

3、小試管置于架上，室溫放置數(shù)分鐘后，觀察兩液面交界處有無(wú)白色沉淀環(huán)。

（五)注意事項(xiàng)

1、抗原：抗體=1：1（體積比)。

2、加抗體時(shí)伸入試管底部。

3、加抗原時(shí)沿管壁緩緩加入。

4、用豚鼠血清和生理鹽水做抗原的對(duì)照。

二、對(duì)流免疫電泳：(counterimmunoelectrophoresis,CIE)

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諏?duì)流免疫電泳的原理、方法和結(jié)果分析

（二)實(shí)驗(yàn)原理：

雙向瓊脂擴(kuò)散與電泳技術(shù)相結(jié)合的方法。

1、半固體瓊脂凝膠：沉淀反應(yīng)是在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行的。半固體瓊脂猶如網(wǎng)狀支架，內(nèi)含大量水分，可溶性抗原和抗體可在其中自由擴(kuò)散。

2、電泳：指液體中的帶電顆粒在外加電場(chǎng)影響下的移動(dòng)現(xiàn)象叫電泳。

3、電滲：是電場(chǎng)中溶液對(duì)于固體的相對(duì)移動(dòng)。

在本實(shí)驗(yàn)中：瓊脂是酸性物質(zhì)，所使用的緩沖液是pH8.0的巴比妥緩沖液，因此在堿性溶液中，固體瓊脂帶負(fù)電；而與它接觸的溶液帶正電，因此液體向陰極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲。 

在瓊脂電泳中，電滲與電泳同時(shí)發(fā)生，物質(zhì)的最終運(yùn)動(dòng)方向取決于合力的方向。液體的流動(dòng)均勻而緩慢，一般不致影響帶電顆粒的電泳方向。但如果帶點(diǎn)顆粒帶電荷少，泳動(dòng)速度慢，電滲作用占主導(dǎo)。

4、液體的pH值高于顆粒的等電點(diǎn)時(shí)顆粒帶負(fù)電荷，溶液的pH值離某物質(zhì)的等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，該物質(zhì)帶的電荷越多。

在本實(shí)驗(yàn)中：

緩沖液：是pH8.0的巴比妥緩沖液。

抗原：等電點(diǎn)4—6，帶負(fù)電。

抗體：等電點(diǎn)6.8-7.2,帶負(fù)電少

分子量大，泳動(dòng)速度慢

電滲作用大于電泳作用

5、負(fù)極側(cè)：加抗原在電場(chǎng)作用下從陰極向陽(yáng)極移動(dòng)

正極側(cè)：加抗體在電滲作用下從陽(yáng)極向陰極移動(dòng)  

在比例最適處形成白色沉淀線。

6、電泳的目的：限制了抗原抗體向多方向的自由擴(kuò)散；加速了泳動(dòng)的速度，所以縮短了反應(yīng)的時(shí)間，僅需30-60分鐘；靈敏度比雙向擴(kuò)散高10-15倍；特異性不如雙向擴(kuò)散，因?yàn)橐粚?duì)以上的抗原抗體系統(tǒng)產(chǎn)生的沉淀線易重疊。

（三)實(shí)驗(yàn)材料

1、抗原：綿羊血清、豚鼠血清

2、抗體：抗綿羊血清

3、生理鹽水、瓊脂板、電泳槽、電泳儀、毛細(xì)滴管

（四)實(shí)驗(yàn)方法

1、打孔

  +Ab  _Ag

用醫(yī)學(xué)全.在線52667788.cn打孔器按照上述所示打孔（不要太靠邊，以防電泳時(shí)不好搭橋)。

2、加樣：加滿，不要溢出。

陽(yáng)極加抗體，Ab：兔抗羊血清；

陰極加抗原，Ag：1:40；1:80；1:160稀釋的羊血清。

各濃度分別作兩份，上下兩組完全相同。

3、電泳：一起電泳。每cm寬度4mA，1個(gè)玻片約10mA，8個(gè)玻片約80mA。電泳40分鐘-50分鐘。搭橋應(yīng)完全緊密接觸，以防電流不均而發(fā)生沉淀線歪曲

（五)注意事項(xiàng)

擴(kuò)散時(shí)間要適當(dāng)。時(shí)間過(guò)短，沉淀線不能出現(xiàn)；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使已形成的沉淀線散開(kāi)而出現(xiàn)假象。

（六)結(jié)果分析

1、沉淀線的位置由抗原抗體的濃度決定：若抗原與抗體的濃度相等，則沉淀線在兩孔中間；若抗體和抗原的濃度不等，則沉淀線靠近濃度低的一方。

2、沉淀線的形狀由抗原抗體的分子量決定：若抗原與抗體的分子量相當(dāng)，則沉淀線成直線；若抗體和抗原的分子量不等，則沉淀線呈弧線，彎向（凹向)分子量大的一方。

三、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(single immunodiffusion)：

定量實(shí)驗(yàn)，常用已知的抗血清測(cè)定未知量相應(yīng)抗原。

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私鈱?shí)驗(yàn)原理及如何用此方法定量檢測(cè)抗原的含量

（二)實(shí)驗(yàn)原理

將抗血清與瓊脂混勻，制成含抗體的瓊脂板，在瓊脂板上打孔，孔內(nèi)加入不同濃度的抗原。因?yàn)榭贵w已與瓊脂混合，所以不會(huì)再擴(kuò)散，只有抗原在瓊脂中由小孔向四周擴(kuò)散，所以命名為單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。擴(kuò)散過(guò)程中，抗原抗體比例合適的部位形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的直徑與加入的抗原濃度成正比。若先以不用濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原作單向擴(kuò)散，以沉淀環(huán)直徑平方為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。待檢抗原的量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出。

應(yīng)用：常用于檢測(cè)體液中免疫球蛋白和補(bǔ)體各成分的含量。

（三)實(shí)驗(yàn)材料

1、抗原：待檢人血清

2、生理鹽水、單向免疫擴(kuò)散瓊脂板、毛細(xì)滴管

（四)實(shí)驗(yàn)方法

1、（每大組一塊)在含有抗體的瓊脂板中分別加入4個(gè)不同濃度的抗原1、2、3、4（加滿但不要溢出)。

2、濕盒中室溫放置48小時(shí)后觀察結(jié)果。

四、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) (double immunodiffusion)

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諏?shí)驗(yàn)原理、方法、應(yīng)用，正確解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（二)實(shí)驗(yàn)原理：抗原和抗體在相同的環(huán)境下自由擴(kuò)散。在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體，抗原和抗體從小孔向四周擴(kuò)散，當(dāng)二者比例合適，形成免疫復(fù)合物的沉淀線�！救舴磻�(yīng)材料中有兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則兩孔間可出現(xiàn)多條沉淀線�！�

應(yīng)用：檢測(cè)抗原或抗體的純度，滴定抗體的效價(jià)；臨床上常用于檢測(cè)AFP，作為原發(fā)性肝癌的重要診斷指標(biāo)。

（三)實(shí)驗(yàn)材料

1、抗原：綿羊血清、豚鼠血清

2、抗體：抗綿羊血清

3、生理鹽水、瓊脂板、毛細(xì)滴管

（四)實(shí)驗(yàn)方法

1、打孔：

2、加樣：中間孔加抗體：兔抗羊血清

四周6個(gè)孔中各孔分別加入：1:40；1:80；1:160；1:320；1:640稀釋的抗原（羊血清)和生理鹽水，加滿但不要溢出；左右兩組相同，同時(shí)作兩份。

3、將瓊脂板置于濕盒中，室溫下放置24小時(shí)后觀察結(jié)果。

（五)結(jié)果分析

上面兩孔為抗原，下面一孔為抗體

⑴  ⑵  ⑶

1、兩抗原完全相同（接口處不象畫(huà)的這樣，而是較模糊，較粗)；

2、兩抗原孔抗原完全不相同；

3、兩抗原部分相同。

原因：擴(kuò)散中抗原抗體形成的沉淀線是半滲透性的屏障，游離的抗原抗體各位于沉淀線的兩側(cè)，特異性抗原、抗體相遇結(jié)合形成的復(fù)合物沉淀于此線，而不對(duì)應(yīng)的抗原抗體則可以自由通過(guò)此沉淀線。

五、示教實(shí)驗(yàn)

（一)火箭電泳(rocket electrophoresis)：是單向擴(kuò)散與電泳技術(shù)相結(jié)合的一種方法。

原理：抗體與瓊脂混合，制成瓊脂板，然后打孔，在孔內(nèi)加入待檢抗原，然后電泳，待檢抗原在電藥品數(shù)據(jù)場(chǎng)作用下泳動(dòng)，當(dāng)與瓊脂中抗體比例合適，形成沉淀線，隨抗原的量減少，沉淀帶越來(lái)越窄，因此形成錐行沉淀線。沉淀峰的高低與抗原的濃度成正比。

應(yīng)用：可用于測(cè)定待檢標(biāo)本中抗原的含量。

（二)免疫電泳(immunoelectrophoresis)：雙向擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合。

原理 ：先將待測(cè)的可溶性抗原在瓊脂板的小孔中電泳，樣品中不同成分的分子量、所帶電荷不同，因此電泳可使其分布于不同的位置。然后在瓊脂板上與電泳平行的方向挖一橫槽，加入相應(yīng)的抗血清，抗原抗體同時(shí)作自由擴(kuò)散，在比例合適處形成沉淀線，根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置、形態(tài)進(jìn)行分析樣品中成分和性質(zhì)。（長(zhǎng)槽內(nèi)加的是針對(duì)各種抗原的混合抗體液。)

應(yīng)用 分析抗原的組分，鑒定提取物濃度

特點(diǎn) 樣品用量少，特異性高，分辨力強(qiáng)等;

但如抗原中各組分含量懸殊時(shí)，不易全部顯示，因此敏感性略差

實(shí)驗(yàn)三 補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：2學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私馊苎�反�?yīng)的原理，掌握溶血反應(yīng)的基本操作方法

二、實(shí)驗(yàn)原理：將綿羊紅細(xì)胞做抗原注射家兔體內(nèi)，經(jīng)一定潛伏期，家兔血清中即出現(xiàn)特異

性抗體，此種抗體稱溶血素，它可以與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，此時(shí)若加入補(bǔ)體，即可激活補(bǔ)體的

經(jīng)典途徑，則呈現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1、溶血素（1：1000)、補(bǔ)體（1：30)、綿羊紅細(xì)胞（1%)、生理鹽水

2、試管、吸管、試管架等

 四、實(shí)驗(yàn)方法

1、按下表將試管4支排成一排，

2、震蕩混勻，37℃水浴30分鐘。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)管因發(fā)生溶血而變紅色透明，其余管為紅細(xì)胞懸液。

六、注意事項(xiàng)

1、取樣品的吸管不可混用；加樣力求準(zhǔn)確；

2、SRBC吹勻后再加；

3、補(bǔ)體穩(wěn)定性差：T、pH、連續(xù)吹打等都使活性下降，所以置于冰浴中，用時(shí)再取；加入補(bǔ)體后輕輕吹打。

實(shí)驗(yàn)四 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：綜合性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饷该庖邩?biāo)記技術(shù)的原理、種類和用途；熟悉和掌握用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)抗原或抗體的原理。

二、實(shí)驗(yàn)原理：酶免疫測(cè)定是一種免疫標(biāo)記技術(shù)，ELISA是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物的高效催化作用結(jié)合起來(lái),利用酶標(biāo)記的抗原或抗體，在固相載體上進(jìn)行抗原或抗體測(cè)定的方法。根據(jù)結(jié)合物中的酶作用底物后顯色，有色產(chǎn)物的量與待測(cè)抗原或抗體的量成正比，根據(jù)顏色變化判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也可以用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度（OD)值作定量測(cè)定抗原或抗體。

三、實(shí)驗(yàn)材料

雙抗體夾心法檢測(cè)乙肝表面抗原的試劑盒

四、實(shí)驗(yàn)方法 按照說(shuō)明書(shū)分配包被抗體的固相載體

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：每組8孔。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照2孔，空白對(duì)照1孔，其余為待檢孔。

2.加樣：各待檢孔：分別加入50μL待檢標(biāo)本1、2、3

陽(yáng)性對(duì)照：每孔加一滴陽(yáng)性對(duì)照液

陰性對(duì)照：每孔加一滴陰性對(duì)照液

空白對(duì)照：什么也不加。（用酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)調(diào)零用)

3．各孔加酶標(biāo)抗體50μL，空白對(duì)照不加。水平快速震蕩混勻1分鐘，37℃水浴30分鐘。

4．洗板：棄液 每孔加滿洗液 30秒鐘后甩去 拍干；重復(fù)4次。

5．顯色：每孔加底物液A液、B液各一滴，37℃水浴15分鐘。（此時(shí)為藍(lán)色)。

6．終止反應(yīng)：每孔加終止液一滴（從水浴取出時(shí)為藍(lán)色，加入終止液后為黃色)。

7．觀察結(jié)果： 目測(cè)：顏色深淺；酶標(biāo)儀定量：測(cè)定OD值。

8、判定標(biāo)準(zhǔn)：待檢標(biāo)本測(cè)得OD值 ≥2.1 ×陰性對(duì)照OD值  （＋)；待檢標(biāo)本測(cè)得OD值 ＜2.1 ×陰性對(duì)照OD值  （－)；若陰性對(duì)照陰性對(duì)照OD值＜0.05，按0.05計(jì)算。

五、注意事項(xiàng)

1、待檢標(biāo)本為注射用疫苗，但仍需小心，不要弄到手上，若弄到手上應(yīng)立即清洗。

2、37℃水浴時(shí)將各孔重新安裝到架子上，蓋膜，加入飯盒內(nèi)，防止液體進(jìn)入各孔。

3、棄液時(shí)，注意方向，不要讓各孔之間的液體交叉。

4、拍干：倒置于衛(wèi)生紙上，拍干，不要用紙伸入孔內(nèi)吸液體。

5、底物液有毒，使用時(shí)小心。

6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，不要清洗板孔，直接將各板孔（包括液體)及試劑倒入垃圾中，切勿到處放置。

實(shí)驗(yàn)五 巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：綜合性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私饩奘杉?xì)胞在非特異性免疫中的作用；觀察巨噬細(xì)胞吞噬異物的形態(tài)。

二、實(shí)驗(yàn)原理：病原微生物、紅細(xì)胞等異物侵入機(jī)體或在體外與巨噬細(xì)胞接觸，巨噬細(xì)胞即進(jìn)行吞噬。取細(xì)胞做涂片，鏡檢計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，可估計(jì)巨噬細(xì)胞的功能。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1、無(wú)菌生理鹽水、雞紅細(xì)胞

2、無(wú)菌注射器、吸管、載玻片、解剖器械、蠟盤(pán)等

四、實(shí)驗(yàn)方法 每組一只小鼠（實(shí)驗(yàn)前已腹腔注射5%淀粉溶液誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞入腹腔)

1、腹腔注射：酵母菌（真菌)或雞紅細(xì)胞1ml/mice，輕揉腹部，放置30分鐘。（使巨噬細(xì)胞有足夠的時(shí)間游走到腹腔并吞噬)

2、打開(kāi)腹腔：拖頸處死小鼠，固定在蠟盤(pán)上；打開(kāi)腹腔，注射生理鹽水：2ml/mice（沖洗作用腹腔中的巨噬細(xì)胞)；吸管在腹腔兩側(cè)吸取腹腔液。

3、推片染色（瑞氏-吉姆薩染色)：

滴片 → 推片→自然干燥 →加染液一滴，混勻放置1分鐘（染液為甲醇配置，甲醇可起固定作用，不需再固定)→加一滴蒸餾水混勻放置3~5分鐘（稀釋后的染料易使細(xì)胞著色)自來(lái)水緩沖，沖至無(wú)浮色（必在染液干之前沖，否則會(huì)有大量的小藍(lán)點(diǎn)，即染料顆粒)    濾紙吸干玻片表面→ 鏡檢（油鏡)。

4、觀察：在高倍鏡即可（雞紅細(xì)胞是一些淡黃色、橢圓形有核的細(xì)胞；而數(shù)量較多，較大的圓形或不規(guī)則的細(xì)胞，其表面具有許多似刺毛狀的小突起(偽足)，即為巨噬細(xì)胞。慢慢移動(dòng)玻片標(biāo)本，仔細(xì)觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的過(guò)程�？梢�(jiàn)有的雞紅細(xì)胞(1-多個(gè))緊附于巨噬細(xì)胞表面;有的巨噬細(xì)胞已將1~數(shù)個(gè)紅細(xì)胞部分吞入;有的巨噬細(xì)胞已吞入1個(gè)或幾個(gè)橢圓形的紅細(xì)胞;有的巨噬細(xì)胞內(nèi)的紅細(xì)胞膜已被被消化，只看到紅細(xì)胞核。)

實(shí)驗(yàn)六 外周血淋巴細(xì)胞分離

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：2學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜び妹芏忍荻入x心法的方法分離外周血淋巴細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)原理：密度梯度離心法，根據(jù)外周血中PBMC比重與血液中其他成分比重不同，采用分離液分離淋巴細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)用比重為1.077的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液（此為人外周血淋巴細(xì)胞分離液，分離豚鼠外周血也可以)。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞比重最大，沉于分離液的下層；分離液比重稍高于淋巴細(xì)胞，所以PBMC在分離液上層；血漿和血小板密度最低，懸浮在最上層。

三、實(shí)驗(yàn)材料 

1、聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液

2、肝素抗凝血、Hank^,s液

3、離心管、離心機(jī)、吸管、試管架

四、實(shí)驗(yàn)方法

1、抗凝取血：豚鼠心臟取血2ml（能多取可以多取，可直接抽血致死)

肝素抗凝：針管中吸0.1—0.2 ml，并推拉針芯潤(rùn)濕管壁，再推出少許使針頭充滿肝素

固定豚鼠：一手把兩個(gè)前爪壓在頸后，另一只手抓住兩后肢，把身體伸平，暴露胸部。

抽血：另一人用手指將心臟推向左側(cè)，大拇指找到心跳最強(qiáng)點(diǎn)（劍突上第4肋處)，肋間進(jìn)針，邊扎邊抽，以免扎的過(guò)深或過(guò)淺。

2、等倍稀釋：2 mlHank’s液＋2 ml血液，吹吸混勻（目的：使血液不太粘稠，容易分離)

3、分離：先加入2 ml淋巴細(xì)胞分離液，再沿管壁緩慢加入4 ml已稀釋血液

4、離心：配平后，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘。離心結(jié)束出現(xiàn)可見(jiàn)分層現(xiàn)象.。

5、用吸管吸取淋巴細(xì)胞。

五、注意事項(xiàng)

1、取血：固定好，針頭不可左右晃動(dòng)，以防劃破心臟，若改變方向需要回到皮下再換方向；推入試管時(shí)，要取下針頭，以免細(xì)胞破碎；

2、分離：先加分離液；分離液與未稀釋血液1：1；加入稀釋血液時(shí)，用滴管沿管壁緩慢加入，不要打散液面；

3、離心：天平調(diào)平――托盤(pán)調(diào)平――試管與套筒一起調(diào)平――轉(zhuǎn)速由慢到快。

實(shí)驗(yàn)七 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：2學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私釫花環(huán)形成的原理，學(xué)會(huì)用E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)鑒定和計(jì)算T淋巴細(xì)胞的方法

二、實(shí)驗(yàn)原理 

常人外周血T淋巴細(xì)胞表面有綿羊紅細(xì)胞受體，即E受體，（又稱CD2)，是T細(xì)胞特有的表面標(biāo)志。在體外一定條件下，T細(xì)胞能直接與綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，形成玫瑰花樣細(xì)胞團(tuán)，稱為E玫瑰花環(huán)�？捎糜跍y(cè)定血液中T細(xì)胞數(shù)目，間接反映細(xì)胞免疫功能。

豚鼠的T細(xì)胞表面有兔紅細(xì)胞受體。避免豚鼠心臟取血不夠用，另取豚鼠胸腺（其中多為T(mén)細(xì)胞)做E玫瑰花試驗(yàn)。需用小豚鼠，因?yàn)槔想嗍蟮男叵僖阎�肪化�?/p>

三、實(shí)驗(yàn)材料 

1、Hank^,s液、兔紅細(xì)胞懸液、戊二醛溶液、甲紫染液

2、 吸管、載玻片、解剖器械、蠟盤(pán)

四、實(shí)驗(yàn)方法

1、取胸腺：處死豚鼠，仰臥位固定于臘盤(pán)，沿腹正中線剪開(kāi)，可見(jiàn)氣管兩側(cè)各有一蠶豆大小的胸腺（質(zhì)稍韌，肉色。確證：在玻片上涂幾下，加一滴甲紫，高倍鏡下觀察)。

2、研磨：銅網(wǎng)置于平皿中，取出胸腺置銅網(wǎng)上，在胸腺上滴加少量Hank’s液，用針芯輕輕研磨，使胸腺細(xì)胞通過(guò)銅網(wǎng)漏入液體中。

3、離心：吸取細(xì)胞懸液于離心管中， 1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，胸腺細(xì)胞沉積于管底。

4、調(diào)細(xì)胞濃度：棄上清，以Hank’s液調(diào)細(xì)胞濃度。

沉淀約0.1ml細(xì)胞壓積+ 2.9mlHank’s液（混勻)——細(xì)胞濃度約為3×10⁶/ml。

5、成花：取0.5ml胸腺細(xì)胞懸液＋0.5ml 1%兔紅細(xì)胞＋一滴小牛血清（保護(hù)細(xì)胞)，混勻， 500轉(zhuǎn)/分 離心5分鐘。

6、滴片：去少量上清，加一滴戊二醛（固定作用，防成花細(xì)胞分離)，輕輕晃動(dòng)試管以剩余的上清懸起細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液，滴玻片，加一滴甲紫，蓋蓋玻片，低倍鏡找到視野，高倍鏡觀察。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

凡結(jié)合3個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞為E花環(huán)陽(yáng)性細(xì)胞。記數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞中形成E花環(huán)的淋巴細(xì)胞百分率，正常值為60%-80%。

六、注意事項(xiàng)

1、取胸腺：小心不要破壞血管，否則混淆視野；

2、研磨：不要干磨，也不要加液體過(guò)多。

3、成花后，以剩余上清重懸細(xì)胞動(dòng)作要輕柔，否則花環(huán)散開(kāi)。

實(shí)驗(yàn)八 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模后w外淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能的實(shí)驗(yàn)方法。了解淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)方法，掌握淋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。

（二)實(shí)驗(yàn)原理 特異性抗原、抗CD3、抗TCR等單抗、絲裂原等均可刺激T淋巴細(xì)胞活化增殖，可通過(guò)觀察T細(xì)胞的活化增殖情況判斷T細(xì)胞的功能是否正常，進(jìn)而反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能是否正常。特異性抗原只能激活對(duì)應(yīng)的T細(xì)胞克隆，所以常用絲裂原，如植物血凝素和刀豆蛋白刺激T細(xì)胞，美洲商陸用于刺激B細(xì)胞。

T淋巴細(xì)胞活化以后，可轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞（P720：細(xì)胞體積變大，為一般淋巴細(xì)胞的3-4倍；胞漿豐富，有偽足樣突起，嗜堿，核周圍有一染色較淺的透明區(qū)，并有空泡；核膜清晰，染色質(zhì)疏松，呈細(xì)網(wǎng)狀，有時(shí)可見(jiàn)1~3個(gè)核仁。除典型母細(xì)胞外，尚可見(jiàn)到過(guò)渡型細(xì)胞，這些細(xì)胞有上述1~2個(gè)特點(diǎn)，如染色質(zhì)疏松，有核仁，胞漿嗜堿，但體積不大)。

T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能水平。

   ³H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR)摻入法；

常用檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法：    MTT法   

鏡檢法（觀察細(xì)胞形態(tài)變化)

正常值：T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60-80%；偏低：50-60%；降低：＜50%

形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法即鏡檢法（全血)：淋巴細(xì)胞受絲裂原刺激后，在轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變，通過(guò)染色鏡檢，即可計(jì)算出淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。

（三)實(shí)驗(yàn)方法：

1)  于無(wú)菌小瓶中加入肝素抗凝血0.3ml，1640培養(yǎng)液2.7ml，絲裂原0.1ml（最終濃度為25～50μg／ml)或NaCl對(duì)照液0.1ml，每種絲裂原及對(duì)照均設(shè)4瓶。（在超凈臺(tái)操作)；

2)  37⁰C溫箱培養(yǎng)3天；

3)  將培養(yǎng)物搖勻，移入離心管內(nèi)，1000 r／min離心10 min，棄上清。取沉淀細(xì)胞做推片，自然干燥后，加甲醇固定3～5min，低溫保存。

4)  姬－瑞氏染色，先加染液1 min后，加等量pH6.9磷酸鹽緩沖液稀釋，繼續(xù)染15～20min，自來(lái)水沖洗，吸干后油鏡觀察。

5)  形態(tài)結(jié)果：

成熟淋巴細(xì)胞：與外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)一致，胞核的染色質(zhì)密集，無(wú)核仁，胞漿少，清度嗜堿性。

過(guò)渡型淋巴細(xì)胞：比成熟淋巴細(xì)胞略大，染色質(zhì)同樣致密，但有明確的核仁1～2個(gè)，細(xì)胞將增多，染色偏深。

淋巴母細(xì)胞：細(xì)胞增大，形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)疏松，核也增大，有明確的核仁1～3個(gè)，胞漿幅度增大，也可看到空泡。

   6)計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算出淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

MTT比色法（單個(gè)核細(xì)胞)：四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT)在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，被還原成藍(lán)黑色的甲臢，形成甲臢的量與細(xì)胞增殖程度呈正相關(guān)。因此通過(guò)測(cè)定細(xì)胞形成甲臢的量，可間接定量分析細(xì)胞的增殖情況。

取分離出的單個(gè)核細(xì)胞層，配成5×10⁶／ml，加3 ml，再加0.1ml絲裂原，加鹽水對(duì)照，培養(yǎng)70h后，加10μlMTT，混勻后，培養(yǎng)4～6小時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)終止后，加酸化異丙醇0.1 ml，充分混勻，靜置數(shù)分鐘，按MTT比色法測(cè)OD值。

計(jì)算SI：SI＝試驗(yàn)孔的OD均值／對(duì)照孔的OD均值。

實(shí)驗(yàn)九 T亞群鑒定

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：綜合性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

一、人外周血淋巴細(xì)胞分離

實(shí)驗(yàn)方法：

1、取血2ml。

2、等倍稀釋：2 mlHank’s液＋2ml血液，吹吸混勻。

3、分離：先加入2 ml淋巴細(xì)胞分離液，再沿管壁緩慢加入4ml已稀釋血液。

4、離心： 2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘。

5、吸取淋巴細(xì)胞，加入5倍體積Hank’s液洗滌，1500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。

6、棄去上清，再加入5倍體積Hank’s液洗滌，1500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。

7、倒掉上清，以回壁的上清重懸細(xì)胞，在劃圈的玻片上滴片，吸起，快速冷風(fēng)吹干，密封，收回。（分3組)

二、 T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：驗(yàn)證性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜げ⒄莆绽�用APAAP法對(duì)外周T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的方法。

（二)實(shí)驗(yàn)原理：

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的一大細(xì)胞群，在正常機(jī)體內(nèi)各個(gè)淋巴細(xì)胞亞群相互作用，維持機(jī)體正常的免疫功能。T淋巴細(xì)胞亞群的分類方法中最常用的是根據(jù)表面標(biāo)志，利用單克隆抗體將其分為不同功能亞群。本試驗(yàn)利用單克隆抗體APAAP法試劑盒檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群。

APAAP法即“堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶”橋聯(lián)酶染色法,是一項(xiàng)免疫組化技術(shù)：將鼠源的抗人T細(xì)胞亞群CD單抗與人T細(xì)胞結(jié)合，再用羊抗鼠的單抗起橋連作用：一個(gè)Fab段連接抗人T細(xì)胞單抗 一個(gè)Fab段連接APAAP復(fù)合物再通過(guò)復(fù)合物中的堿性磷酸酶催化底物顯色來(lái)判斷CD分子的存在，確定T細(xì)胞各亞群的數(shù)目。（如下圖)

一抗：鼠抗人T淋巴細(xì)胞的單抗（與待測(cè)抗原結(jié)合)；

二抗：山羊抗鼠球蛋白的單抗（起橋聯(lián)用)一個(gè)Fab段連接一抗，

一個(gè)Fab段連接APAAP復(fù)合物；

三抗（APAAP復(fù)合物)：鼠抗堿性磷酸酶的單抗和堿性磷酸酶形成的免疫復(fù)合物

三、實(shí)驗(yàn)材料

1、劃圈筆、玻片、封口袋

2、固定液、底物液、堅(jiān)固紅、復(fù)染液、生理鹽水(NS)、PBS

3、鼠抗人T亞群?jiǎn)慰寺】贵w：抗CD3⁺單抗、抗CD4⁺單抗、抗CD8⁺單抗

4、抗鼠IgG二抗

5、APAAP復(fù)合物

四、實(shí)驗(yàn)方法

1、標(biāo)本制備：從外周血中用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用NS洗滌細(xì)胞3次。取細(xì)胞懸液滴于玻片，再吸取液滴，剩一薄層細(xì)胞，快速冷風(fēng)吹干，如不立即染色，封口袋密封，-20℃保存。（已完成)

2、固定：滴一滴固定液于標(biāo)本上，固定2分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，濾紙吸干。

3、加一抗：分別加鼠抗人T細(xì)胞CD3、CD4、CD8單抗10μl，放濕盒37℃水浴溫育25分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，濾紙吸干。

4、加二抗：羊抗鼠IgG二抗10μl，放濕盒37℃水浴溫育25分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，吸干。

5、加APAAP復(fù)合物：10μl，放濕盒37℃水浴溫育25分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，濾紙吸干。

6、顯色：滴加底物液（底物液1ml+堅(jiān)固紅1mg，混勻，充分溶解)20μl，放濕盒37℃水浴溫育15分鐘，自來(lái)水沖洗終止顯色。

7、復(fù)染：蘇木素復(fù)染液1滴，染色1分鐘，自來(lái)水洗。

8、結(jié)果觀察：高倍鏡下，細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞表面有紅色標(biāo)記物的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)100－200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

思考題

1、T細(xì)胞亞群的檢測(cè)有何意義？

2、其他檢測(cè)T細(xì)胞亞群的方法有哪些？

實(shí)驗(yàn)十 免疫血清的制備與檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：綜合性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

實(shí)驗(yàn)要求：

根據(jù)已學(xué)過(guò)的知識(shí)，自行設(shè)計(jì)免疫血清的制備和檢驗(yàn)程序(包括實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)方法)并進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：動(dòng)物免疫，血清中抗體的檢測(cè)。

免疫血清的制備  免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高效價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體，常可獲得高效價(jià)的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時(shí)，則需同時(shí)加用佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時(shí)間間隔等，也是影響免疫血清效價(jià)的重要因素，應(yīng)予重視。

一、原理　具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。

二、免疫方法　根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異，我們制備小鼠抗羊RBC的抗體采用的是腹腔注射免疫。

三、實(shí)驗(yàn)步驟：

1、  免疫小鼠：7天前（一般為5天，因?yàn)槲覀兊膶?shí)驗(yàn)課一周一次)免疫小鼠（2%羊紅細(xì)胞0.2ml腹腔注射)；

2、  取外周血：摘除眼球取血于離心管內(nèi)（一只小鼠用此法一般可收集1毫升血，每1毫升血可分離出0.3-0.4毫升的血清)。

3、  分離血清：血液室溫放置1小時(shí)后，分離血清，離心血清，1500轉(zhuǎn)/分，10-15分鐘（因?yàn)檠�清量少，不離心吸取血清時(shí)易吸上RBC。同時(shí)離心也可去除血清中的絲狀物)，取出血清，-20℃保存；（以下下節(jié)課做)

4、  溶血素活性測(cè)定：將受檢血清在試管內(nèi)等倍稀釋，加入定量補(bǔ)體和羊紅細(xì)胞，孵育后觀察試管中的溶血反應(yīng)，評(píng)價(jià)待檢血清中的抗體活性。（類似試管凝集反應(yīng))

⑴ 稀釋血清：從冰箱中取出血清，室溫放置至血清融化。血清用pBS緩沖液稀釋300倍，吹打混勻；

⑵  加液：取1ml稀釋后的血清，加入10%SRBC 0.5ml，補(bǔ)體1ml，對(duì)照管用緩沖液代替血清；

⑶  孵育：37℃恒溫水浴15-30分鐘，冰浴終止反應(yīng)；

⑷ 測(cè)量結(jié)果：離心，2000轉(zhuǎn)/分鐘，10min，取上清1ml，都氏試劑（內(nèi)含氫化物，可破壞RBC，以防止上清中混有的RBC影響檢測(cè)結(jié)果)3ml加于測(cè)試板中，混勻，酶標(biāo)儀540nm測(cè)吸光度值。

實(shí)驗(yàn)十一 體液免疫檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：設(shè)計(jì)性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：4-6人

實(shí)驗(yàn)要求：

要求學(xué)生自行設(shè)計(jì)檢驗(yàn)程序(包括實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)方法)并進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：

1、用已知抗體鑒定未知細(xì)菌；

2、用已知抗原檢測(cè)雙份血清中的抗體效價(jià)；

實(shí)驗(yàn)十二 小鼠細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)性質(zhì)：開(kāi)放性

實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)

學(xué)生分組人數(shù)：隨機(jī)

實(shí)驗(yàn)要求：小鼠細(xì)胞免疫功能分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩大類，包括吞噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等學(xué)生在所學(xué)知識(shí)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具備的條件，設(shè)計(jì)出可行的實(shí)驗(yàn)方法，可以檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，也可以檢測(cè)細(xì)胞功能，全面考察小鼠的細(xì)胞免疫功能。

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：自選

說(shuō)明：本次實(shí)驗(yàn)學(xué)生還可以根據(jù)自己的興趣選擇有關(guān)的實(shí)驗(yàn)，教研室全力支持。

附錄（綜合和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)參考)

多克隆抗體的制備

抗體是機(jī)體在抗原刺激下所產(chǎn)生的特異性球蛋白。是免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物，亦是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的試劑，對(duì)于抗原的分析鑒定和定量檢測(cè)極為重要，在各種免疫學(xué)診斷中應(yīng)用極為廣泛。目前人工制備的特異性抗體分為三種類型，即多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。多克隆抗體的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高效價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體，�？色@得高效價(jià)的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時(shí)，則需同時(shí)加用佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時(shí)間間隔等，也是影響免疫血清效價(jià)的重要因素，應(yīng)予重視。

  一、免疫動(dòng)物

  （一)動(dòng)物的選擇

  供免疫的動(dòng)物有哺乳類和禽類，常選用家兔、山羊或綿羊、馬、騾和豚鼠等。動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的特性和所要獲得的抗體的量和用途。

（二)抗原及抗原計(jì)量的選擇

不同抗原的免疫原性強(qiáng)弱不一，這取決于其分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)、物理性狀和彌散速度等�？乖�的免疫劑量依照給予抗原的種類、免疫次數(shù)、注射途徑以及受體動(dòng)物的種類、免疫周期及所要求的抗體特性等而不同。

（三)免疫方案

 抗原注射途徑可根據(jù)不同抗原及試驗(yàn)要求，選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔等不同途徑注入抗原進(jìn)行免疫。以顆粒性抗原免疫小鼠為例，具體方案如下：

1.主要材料：健康昆明小鼠數(shù)只；2%羊紅細(xì)胞懸液

2.免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2ml 2%羊紅細(xì)胞懸液。7天后取外周血：摘除眼球取血于離心管內(nèi)（一只小鼠用此法一般可收集1毫升血，每1毫升血可分離出0.3-0.4毫升的血清)。分離血清：血液室溫放置1小時(shí)后，分離血清，離心血清，1500轉(zhuǎn)/分，10-15分鐘（因?yàn)檠�清量少，不離心吸取血清時(shí)易吸上RBC。同時(shí)離心也可去除血清中的絲狀物)，取出血清，如不立即鑒定，-20℃保存

3.抗血清的鑒定：溶血素活性測(cè)定：將受檢血清在試管內(nèi)等倍稀釋，加入定量補(bǔ)體和羊紅細(xì)胞，孵育后觀察試管中的溶血反應(yīng)，評(píng)價(jià)待檢血清中的抗體活性。

⑴ 稀釋血清：從冰箱中取出血清，室溫放置至血清融化。血清用pBS緩沖液稀釋300倍，吹打混勻；

⑷  加液：取1ml稀釋后的血清，加入10%SRBC 0.5ml，補(bǔ)體1ml，對(duì)照管用緩沖液代替血清；

⑸  孵育：37℃恒溫水浴15-30分鐘，冰浴終止反應(yīng)；

⑷ 測(cè)量結(jié)果：離心，2000轉(zhuǎn)/分鐘，10min，取上清1ml，都氏試劑（內(nèi)含氫化物，可破壞RBC，以防止上清中混有的RBC影響檢測(cè)結(jié)果)3ml加于測(cè)試板中，混勻，酶標(biāo)儀540nm測(cè)吸光度值。計(jì)算血清中抗體的效價(jià)。

附表

河北醫(yī)科大學(xué)設(shè)計(jì)（綜合)性實(shí)驗(yàn)開(kāi)題報(bào)告