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2.1.3 傳代培養(yǎng)
待細胞長滿瓶底80%，取出蓋玻片，用眼科鑷夾出組織塊后，將0.25% 胰蛋白酶1.0 ml加入培養(yǎng)瓶，輕搖至消化液流遍所有細胞表面后，倒掉消化液后再加1.0 ml 新的消化液進行消化，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后立即加入含血清的DMEM 培養(yǎng)液中止消化。用吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，收集細胞懸液，低速離心(800 rpm, 5 min)。計數(shù)，按1:2 比例從6 孔板傳代于培養(yǎng)瓶中，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。
2.1.4 細胞生長曲線的測定
取生長良好的 1～3 代細胞，計數(shù)后以2×104/ml 的細胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，每個時相點細胞接種4 孔，每孔100μL 細胞懸液。置于5% CO2 飽和濕度、37℃恒溫箱下培養(yǎng)。從第2 天起，每天上午同一時間開始加入濃度為5 mg/ml 的3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽(MTT)10 μl 混勻, 繼續(xù)孵育4h 后加入100μl 十二烷基硫酸鈉(SDS)，用酶聯(lián)免疫檢測儀上570 nm 處檢測每個孔的吸光度(OD 值)，取平均值，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸，以不加細胞只加培養(yǎng)液的空白孔為對照。連續(xù)測一周，繪制生長曲線。
2.1.5 甲苯胺藍染色取第 1 代培養(yǎng)細胞，固定后加入10 g/L 甲苯胺藍染液，室溫下染色30min，蒸餾水洗，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察細胞的染況，照相記錄。
2.1.6 I 型膠原免疫組化染色細胞傳代后，以第1 代作細胞爬片，培養(yǎng)第4 天時取出，PBS 液沖洗3 次，用4% 多聚甲醛固定30min，蒸餾水洗，入體積分數(shù)3%的過氧化氫室溫孵育5min，滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育10min，傾去血清后滴加適當比例稀釋的I 型膠原蛋白一抗工作液(1:50)，4℃過夜；PBS 沖洗，3 min×3 次；滴加生物素標記山羊抗小鼠IgG，37℃,15 min；PBS 沖洗，3 min×3 次；滴加試劑辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃，10 min；DAB 顯色劑室溫顯色3 min 后，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。鏡下觀察細胞的染況，照相記錄。
2.1.7 主要觀察指標在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞的形態(tài)變化及貼壁率，甲苯胺藍染色、I 型膠原免疫組化染色進行細胞鑒定，測定其生長曲線。
3 結(jié)果
3.1 倒置顯微鏡觀察
細胞的形態(tài)學(xué)及生長情況培養(yǎng)至第 4 天，在組織塊的周邊區(qū)域可見爬出的細胞，散在排列，細胞呈梭形或三角形。
7 天后，細胞為長梭形，多角形，部分細胞突起互相連接。培養(yǎng)至第10 天,細胞彼此相連，長滿整個培養(yǎng)皿底面的80%，有細胞重疊現(xiàn)象，此時應(yīng)適時傳代。傳代后1h 細胞即開始貼壁。2h 后開始伸展，貼壁細胞形態(tài)為多角形，短梭形。6h 已經(jīng)能適應(yīng)體外培養(yǎng)條件，增殖速度加快，4～5 天后即可貼滿瓶底。
