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1 材料與方法
1.1 材料 人宮頸癌Hela細胞由河北醫(yī)科大學病理教研室提供;大蒜素(二烯丙基代磺酸酯)購于河北醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)院藥房;四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Ho33342、碘化丙啶(PI)為美國Sigma產(chǎn)品;DMEM、新生牛血清為美國Gibco產(chǎn)品;Bcl2、Bax單克隆抗體購自美國BD公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng):人宮頸癌Hela細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期細胞進行分組實驗。
1.2.2 MTT法檢測大蒜素對細胞增殖的影響：細胞以5×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入不同濃度的大蒜素各100 μl，濃度分別為1、5、10、20 μg/ml，對照組加入含10%FBS的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，分別向每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩5 min;酶標儀檢測(吸光度為550 nm)。每時間濃度組設3個復孔，實驗重復3次。所得OD值根據(jù)公式計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD正常組)×100%，以空白組OD值調(diào)零。
1.2.3 大蒜素誘導宮頸癌：Hela細胞凋亡最適濃度篩選以上各實驗組加入大蒜素作用24 h，加入Ho33342(濃度10 μg/ml)37℃溫育20 min，再加入PI(濃度50 μg/ml)，熒光顯微鏡觀察并記錄圖象。
1.2.4 細胞形態(tài)學觀察：10 μg/ml大蒜素分別作用0～24 h，每隔2 h顯微鏡觀察1次，隨機選取視野記錄圖象。
1.2.5 流式細胞儀檢測：大蒜素對細胞周期的影響：細胞以5×104/ml-1接種于25 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后，加入10 μg/ml大蒜素，分別培養(yǎng)12、24 h，棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心8 min收集細胞。細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，500 μl PBS懸浮細胞，加入含10 μg/ml的RNase的PI，4℃染色30 min。經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，上機檢測。實驗結(jié)果采用Modifit軟件進行細胞周期各期的百分率分析。實驗重復3次。
1.2.6 流式細胞儀檢測大蒜素對Bcl2和Bax的影響：細胞以5×104/ml接種于25 cm2培養(yǎng)中，培養(yǎng)48 h后，加入10 μg/ml大蒜素分別培養(yǎng)12和24 h，收集細胞，以PBS清洗3次，70%乙醇4℃固定1 h。經(jīng)PBS再次清洗后，不同時間組細胞分別加入兔抗人Bcl2或兔抗人Bax一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗后加入FITC標記山羊抗兔二抗，37℃避光孵育20 min。陰性對照PBS代替一抗。PBS 清洗3次后上流式細胞儀檢測，實驗重復3次。
1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.0統(tǒng)計件，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義醫(yī).學全.在.線網(wǎng)站52667788.cn。
2 結(jié)果
2.1 大蒜素對宮頸癌Hela細胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示1～10 μg/ml大蒜素均能抑制Hela細胞的增殖 ，呈時間劑量依賴性關系;20 μg/ml大蒜素細胞毒性作用明顯，作用12 h，細胞抑制率為74.71%，作用24 h以后細胞幾乎全部死亡。見表1。表1 大蒜素對Hela細胞增殖的抑制作用
2.2 大蒜素誘導宮頸癌Hela細胞凋亡最適濃度的篩選Ho33342和PI染色結(jié)果提示，各濃度組中，10 μg/ml大蒜素對Hela細胞誘導凋亡作用最明顯;20 μg/ml大蒜素主要表現(xiàn)為細胞毒性作用。因此，本實驗選取10 μg/ml作為最適誘導濃度來探討其作用機制。
2.3 細胞形態(tài)學觀察正常條件下Hela細胞呈梭形或多角形，傳代培養(yǎng)48 h，細胞貼壁生長，有聚團現(xiàn)象;10 μg/ml大蒜素作用6 h，細胞開始出現(xiàn)形態(tài)學改變，緊貼瓶壁的細胞邊界模糊，部分細胞縮起，分裂相減少;大蒜素作用12 h開始有凋亡小體出現(xiàn);大蒜素作用24 h，大部分細胞回縮變圓，凋亡小體明顯，部分細胞懸浮于培養(yǎng)基中，細胞碎片增多。
