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1.2 實驗動物模型制作及分組 實驗組分4組：在腦立體定位儀上將新鮮配制的5%6-OHDA 4 μl溶于0.01%含抗壞血酸的生理鹽水中(冰浴避光)，注入右側(cè)的SNc、CPu、VTA和FrA腦區(qū)(即SNc組、CPu組、VTA組、FrA組)，分別于注射后1、7、14 d灌注取材，每組每個時間點各3只大鼠;對照組(saline組)相應(yīng)腦區(qū)注射生理鹽水，注射部位、劑量及取材時間同實驗組。
1.3 免疫組織化學(xué)染色 大鼠麻醉后，常規(guī)灌注固定、取腦后行冠狀位連續(xù)冰凍切片，片厚30 μm，隔四取一，依據(jù)Paxinos和Watson的大鼠腦圖譜，挑選每只大鼠SNc、CPu、VTA和FrA 4個腦區(qū)的切片各1套(6張/套)。切片用0.01 mol/L PBS(pH7.4)洗滌3次，每次10 min;用8%正常山羊血清室溫封閉30 min，吸去血清，加小鼠抗GFAP(1︰2000)孵育3 d，加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1︰200)孵育2 d;用PBS洗滌3次，每次10 min;新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和H2O2混合反應(yīng)液顯色。反應(yīng)完畢后常規(guī)脫水透明，顯微鏡下觀察并拍照。對照組操作步驟同上。
2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
saline組大鼠各部位腦切片中，星形膠質(zhì)細胞為靜息狀態(tài)，胞體小，在切片上不易發(fā)現(xiàn)(圖1，見封二)。6-OHDA局部注射1 d后，各腦區(qū)星形膠質(zhì)細胞有輕度反應(yīng)，細胞淺染，細胞形態(tài)隱約可見，不規(guī)則;6-OHDA注射7 d后，星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)非常明顯，細胞深染，胞體變大，形態(tài)清楚，可見突起增粗;各腦區(qū)間以SNc和VTA腦區(qū)的反應(yīng)更加顯著(圖2，見封二);6-OHDA注射14 d后，仍可見星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)，但已經(jīng)減弱。
3 討 論
星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)細胞中數(shù)量最多的(10倍于神經(jīng)元的數(shù)量)，它位于神經(jīng)元胞體和突起的周圍，參與維持和調(diào)理細胞外環(huán)境，攝取和釋放神經(jīng)遞質(zhì)，提供營養(yǎng)、能量物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)前體，調(diào)整中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)和幫助維持血腦屏障，并促進神經(jīng)元的生長、修復(fù)和再生[2-3] 醫(yī)學(xué) 全在.線提供52667788.cn。
在6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型及PD患者腦中都發(fā)現(xiàn)CPu和SNc腦區(qū)膠質(zhì)細胞出現(xiàn)明顯反應(yīng)。被激活的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，胞體變得肥大，突起變短增粗，染色變深。同時被激活的膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生一些神經(jīng)有害分子比如促炎癥因子、前列腺素、活性氧、一氧化氮等[4-9]，進一步加重DA能神經(jīng)元的損傷，而損傷的DA能神經(jīng)元又會加重膠質(zhì)細胞的反應(yīng)。然而反應(yīng)性膠質(zhì)細胞在一定炎癥程度范圍內(nèi)會產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子(如BDNF、GDNF)及激活抗氧化應(yīng)激和抗炎系統(tǒng)，從而對DA能神經(jīng)元起保護作用。由此可見，SNc部位DA能神經(jīng)元胞體和CPu部位DA能神經(jīng)末梢在退變過程中與周圍膠質(zhì)細胞形成的非神經(jīng)元環(huán)境進行了大量的“cross-talk”，反應(yīng)性膠質(zhì)細胞在DA能神經(jīng)元退變進程中發(fā)揮了重要作用[10-13]。SNc臨近腦區(qū)VTA同樣富含DA能神經(jīng)元胞體，其軸突主要投射至FrA腦區(qū)。
本實驗結(jié)果提示大鼠相關(guān)腦區(qū)中的星形膠質(zhì)細胞對6-OHDA局部注射后的反應(yīng)存在差異，我們推測可能由于：(1)SNc、VTA腦區(qū)的DA能神經(jīng)元和CPu、FrA腦區(qū)的DA能神經(jīng)元末梢本身特性不同，從而對神經(jīng)毒劑敏感性不同;(2)這些腦區(qū)DA能神經(jīng)元胞體及末梢所處的環(huán)境(膠質(zhì)細胞形成)不同，膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元損傷及神經(jīng)毒劑的反應(yīng)性存在差異。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞在DA能神經(jīng)元退變過程中發(fā)揮神經(jīng)保護作用或神經(jīng)毒性損傷作用以及其機制還需要進一步探討。
