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醫(yī)學(xué)免費(fèi)論文:深部真菌感染的分子生物學(xué)檢測研究進(jìn)展
關(guān)鍵詞：分子生物學(xué) 真菌病
深部真菌感染指真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟所引起的感染性疾病, 包括局限性的單一器官感染和2個(gè)或2個(gè)以上器官或組織受侵犯的系統(tǒng)性真菌感染。深部真菌感染發(fā)病率逐年增高, 其病死率高, 癥狀變化多樣, 早期診斷方法有限。本文就分子生物學(xué)方法在深部真菌感染診斷中的研究現(xiàn)狀作一綜述。
1流行現(xiàn)狀
深部真菌感染多發(fā)生在醫(yī)院內(nèi), 主要由念珠菌、曲霉菌和隱球菌所致。其中念珠菌仍是血液系統(tǒng)感染的主要致病菌。念珠菌感染中以白色念珠菌、熱帶念珠菌感染多見, 但近年來隨著新一代抗真菌藥物的應(yīng)用, 光滑念珠菌和克柔念珠菌感染患者增多, 并出現(xiàn)耐藥。曲霉菌是繼念珠菌之后第二常見的真菌病原體, 臟器移植患者的曲霉菌感染發(fā)生率高達(dá)30% , 病死率達(dá)60%～90%。隱球菌的主要致病類型是新型隱球菌, 隱球菌感染是艾滋病常見的并發(fā)癥。
一項(xiàng)覆蓋64% 丹麥人群的調(diào)查發(fā)現(xiàn), 2004/2006 年的真菌血癥的年平均發(fā)病率為10. 4/100 000, 每年增加17%。流行病學(xué)顯示不僅病原菌的種類發(fā)生了變化, 且隨著新型抗真菌藥物的應(yīng)用, 真菌的耐藥性也發(fā)生了變化。Sar等利用Etest法檢測402株新型隱球菌對氟康唑的敏感性, 2a間對氟康唑耐藥的菌株增加了11. 5%。
2深部真菌感染的非培養(yǎng)方法
2. 1血清學(xué)檢測目前應(yīng)用于臨床真菌血清學(xué)檢測方法主要是檢測血循環(huán)中的抗原, 包括β－D－1, 3葡聚糖(BDG)和半乳甘露聚糖(GM)。BDG 是除接合菌和隱球菌以外的真菌胞壁的主要成分之一, 不存在于細(xì)菌、病毒和人類細(xì)胞中, 是一種真菌廣譜循環(huán)標(biāo)志物可用于念珠菌病及曲霉病的早期診斷。GM是存在于曲霉和青霉細(xì)胞壁上的一種熱穩(wěn)定多糖, 是第一個(gè)用于侵襲性曲霉病的抗原, 其商品化檢測試劑盒在歐洲已經(jīng)使用了10a余, 美國也于近年批準(zhǔn)臨床使用。GM檢測標(biāo)本可以使用血液或支氣管肺泡灌洗液以及尿液、腦脊液等標(biāo)本。血清學(xué)方法方便快速, 然而不能精確到真菌的種, 對治療用藥有一定影響; 且某些食物、藥物也可影響檢測結(jié)果, 目前沒有廣泛應(yīng)用于臨床。
2. 2分子生物學(xué)方法DNA指紋技術(shù)包括限制性片斷長度多態(tài)性分析(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)、電泳核型(elect ropho ret ic karyo type) 等。對于已知分類的微生物, 可通過DNA 片斷比較株系間的同源差異, 對于未知微生物需通過標(biāo)準(zhǔn)菌種DNA 指紋圖庫比較后確定醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站52667788.cn。
基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 的分子生物學(xué)方法如巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等是目前真菌感染診斷中最活躍的領(lǐng)域, 關(guān)鍵是根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合適的引物。最常選用的目的片段是rDNA 復(fù)合體。真核生物編碼核糖體核酸的基因(rDNA)是一個(gè)串聯(lián)的重復(fù)轉(zhuǎn)錄單位, 即18S rDNA－ITS－5. 8S rDNA－28SrDNA , 約100～ 200 拷貝, 包括編碼區(qū)和非編碼區(qū); 分隔編碼區(qū)18S、5. 8S、28S rDNA 亞單位的ITS 為非編碼區(qū)。編碼區(qū)序列相對保守, 而ITS 在兩代之間進(jìn)化很快, 常發(fā)生變異, 在同一屬種間甚或種內(nèi)可有不同程度的差異, 所以rDNA ITS 序列具有菌種分類鑒定的意義。
3分子生物學(xué)方法的研究現(xiàn)狀
DNA 指紋分型技術(shù)可以做到準(zhǔn)確分類鑒定病原但主要用于流行病分型研究。近來將RFLP、PCR與雜交技術(shù)結(jié)合起來,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析可彌補(bǔ)單純RFLP分析時(shí)結(jié)果模糊之缺陷。Asticcioli等用RAPD方法證實(shí)在一新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中爆發(fā)流行的深部念珠菌病為兩株白色念珠菌所致。電泳核型是把整個(gè)染色體包埋在瓊脂糖凝膠中, 依賴染色體的大小和立體結(jié)構(gòu), 通過在凝膠中遷移的速度把基因組分離成染色體帶。Shin等在36d內(nèi)從15位光滑念珠菌血癥患者血中分離出得到41 株光滑念株菌, 用PFGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)同一患者血中連續(xù)分離得到的光滑念珠核型在迅速地發(fā)生變化并證實(shí)光滑念珠菌對唑類藥物耐藥性的獲得與使用該類藥物治療所致誘導(dǎo)耐藥相關(guān)。各種改良的PCR技術(shù)可以簡便、快速地鑒定多種醫(yī)學(xué)重要真菌。(1) 巢式PCR (nested PCR):使用巢式引物進(jìn)行多輪擴(kuò)增可提高特異性和靈敏度。Margit等用巢式PCR方法檢測深部感染煙曲霉的動物模型, 檢測下限達(dá)1CFU/ml。Hummel等用相同方法檢測了疑似腦曲霉病的6 位血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的腦脊液, PCR結(jié)果臨床癥狀有良好的相關(guān)性。在巢式PCR 研究中要特別避免出現(xiàn)假陽性, 環(huán)境中存在著大量曲霉孢子很容易對樣本和試劑造成污染應(yīng)通過嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室檢測規(guī)范以及設(shè)置對照來控制。(2) 多重(mult ip lex PCR ) : Carvalho 等用一對通用引物結(jié)合八個(gè)種特異引物擴(kuò)增ITS125. 8sRNA－ITS2片斷, 可同時(shí)鑒定出8種念珠菌, 精確度可達(dá)2 CFU/ml, 可在5h內(nèi)得到結(jié)果。Giorgio等利用多重PCR方法直接檢測口腔念珠菌患者的口腔清洗液標(biāo)本, 可以鑒定10種念珠菌, 且將檢測時(shí)間也短至5h。(3) 實(shí)時(shí)定量PCR: 精確地定量出測樣品中的基因數(shù)量, 利于PCR質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立。Vo llmer 等依據(jù)28SrDNA 基因的部分序列設(shè)計(jì)廣譜引物用實(shí)時(shí)定量PCR 來檢測可將對人致病的重要真菌鑒定到屬, 包括曲霉屬, 假絲酵母菌屬, 毛霉屬, 隱球菌屬等。他們用這種方法檢測了呼吸機(jī)支持通氣的重癥監(jiān)護(hù)患者的76 份氣管抽吸物標(biāo)本和患有感染性心內(nèi)膜炎的患者的70 份瓣膜組織標(biāo)本。臨床上通過組織病理學(xué)檢查很難將接合菌與其他絲狀真菌鑒別, 但使用熒光定量PCR 技術(shù), 根據(jù)接合菌高度保守的細(xì)胞色素b 基因序列來設(shè)計(jì)特異引物和雜交針探可以鑒定出檢測新鮮組織樣品中小克銀漢霉屬、毛霉屬、根霉菌屬等五種接合菌, 敏感性和特異性均為100%。
