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1 材料與方法
1.1 動物與分組
成年SPF級雄性SD大鼠(250 ～ 300 g)，由中山大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠隨機分為16組(n = 6)：對照組(生理鹽水)、鞘內(nèi)七葉皂苷組(5、10、20、40 μg)、鞘內(nèi)可樂定組(1、2、5、10 μg)、鞘內(nèi)混合藥物組為1/2、1/4、1/8、1/16(七葉皂苷ED50 + 可樂定ED50)、鞘內(nèi)拮抗組(育亨賓20 μg + 可樂定10 μg、育亨賓20 μg + 七葉皂苷20 μg、育亨賓20 μg + 七葉皂苷1/2 ED50 + 可樂定1/2 ED50)。ED50是指能使甲醛炎癥痛模型大鼠疼痛反應(yīng)較對照組減少50%時的藥物劑量。
實驗用藥：七葉皂苷(Escin)、可樂定(Clonidine)、育亨賓(Yohimbine)和利多卡因(Lidocaine)均為美國Sigma公司產(chǎn)品醫(yī).學(xué).全.在.線52667788.cn。
1.2 蛛網(wǎng)膜下腔置管
采用Zeng等[4]的方法進(jìn)行大鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管。處死置管后出現(xiàn)運動障礙者，管內(nèi)注射20 g/L利多卡因(10 μL)，30 s內(nèi)出現(xiàn)雙后肢麻痹則說明導(dǎo)管位置正確。剔除導(dǎo)管位置不正確者，待大鼠恢復(fù)4 ～ 5 d后，再進(jìn)行下一步實驗。
1.3 蛛網(wǎng)膜下腔用藥
所有用藥均用生理鹽水溶解成10 μL溶液，藥物注射完后均用10 μL 生理鹽水沖洗蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管。鞘內(nèi)用藥10 min后制作甲醛炎癥痛模型并做行為學(xué)測試，完畢后再次判斷導(dǎo)管位置是否正確(方法同前)。
1.4 運動功能評估
按下述方法對大鼠運動功能進(jìn)行評估：0 = 自由活動無任何限制;1 = 活動受限或后肢運動不協(xié)調(diào); 2 = 后肢無力支撐軀體但仍可活動或?qū)μ弁创碳び蟹磻?yīng); 3 = 后肢完全癱瘓。
1.5 甲醛炎癥痛模型制作及行為學(xué)測試
按Yoon等[5]的方法，用1 mL注射器(25 G針頭)將50 μL 20 mL/L甲醛溶液注射到大鼠右后足跖面皮下，剔除局部出血者。甲醛炎癥痛表現(xiàn)為典型的雙相性，一般認(rèn)為：0 ～ 5 min為Ⅰ相，5 ～ 10 min 為間歇期，10 ～ 60 min為Ⅱ相。
參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行疼痛行為學(xué)評分：0分 = 大鼠行為正常，雙后肢均承重;1分 = 大鼠被注射肢體輕觸玻璃臺面，輕微承重或不承重;2分 = 大鼠完全縮回被注射側(cè)肢體;3分 = 舔、咬或抖動被注射側(cè)肢體。以縮腿及舔爪 (即行為學(xué)評分 > 2) 作為退縮反應(yīng)(Flinch)的標(biāo)準(zhǔn)，以0 ～ 10 min 為Ⅰ相，11 ～ 60 min為Ⅱ相，記錄60 min內(nèi)每5 min的退縮反應(yīng)時間(s)。
1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析
以每5 min的退縮反應(yīng)時間繪制時間-反應(yīng)曲線，用線性回歸方法計算七葉皂苷和可樂定Ⅰ、Ⅱ相ED50及其95%置信區(qū)間(95% Confidence intervals，CI95)。為計算ED50，以實驗組與對照組退縮反應(yīng)時間比 × 100%作為抗傷害作用百分比(maximal possible effect， rMPE)， ED50即 rMPE = 50%時的藥物劑量。 根據(jù)得到的兩藥的ED50進(jìn)行混合組的實驗，用線性回歸的方法計算兩藥混合時各自的ED50及CI95。參照文獻(xiàn)描述[7]的輻射分析法(Isobolograms)對七葉皂苷和可樂定的相互作用進(jìn)行評價。將可樂定和七葉皂苷的ED50及其CI95分別標(biāo)注于x軸和y軸上，連接兩藥ED50而成的直線就是兩藥混合作用時的理論相加線。同時，在圖中標(biāo)示出混合組兩種藥物各自的ED50及其CI95。假設(shè)兩藥混合使用僅有相加作用，按文獻(xiàn)[8]的方法計算理論上兩藥各自的ED50，標(biāo)注于理論相加線上。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤(x ± sx)表示，組間對比采用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析，七葉皂苷-可樂定混合用藥組理論ED50和實驗ED50比較采用t檢驗。P < 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
2 結(jié) 果
2.1 七葉皂苷抗炎癥痛作用
兩組大鼠用藥后均未發(fā)現(xiàn)運動功能異常。注射甲醛溶液后，大鼠立即出現(xiàn)疼痛反應(yīng)，表現(xiàn)為抬高、舔咬注射足，可觀察到完整的雙相疼痛反應(yīng)。鞘內(nèi)注射七葉皂苷5、10、20、40 μg對甲醛炎癥痛Ⅰ相無明顯抑制作用;鞘內(nèi)注射5、10 μg七葉皂苷對Ⅱ相痛有微弱抑制作用，但無統(tǒng)計學(xué)意義;而注射20、40 μg時則產(chǎn)生了明顯抗炎癥痛作用(P<0.01)，其峰值出現(xiàn)在40 min左右，且呈明顯的劑量依賴性(圖1)，其ED50為16.71 μg(CI95為11.06 ～ 22.36 μg)。
2.2 可樂定抗炎癥痛效應(yīng)
鞘內(nèi)可樂定1 μg對甲醛炎癥痛Ⅰ、Ⅱ相有微弱抑制作用，但無統(tǒng)計學(xué)意義;鞘內(nèi)可樂定2 μg對Ⅱ相痛有一定抑制作用(P < 0.05);劑量達(dá)5 μg 和10 μg時對Ⅰ、Ⅱ相疼痛均有明顯抑制作用(P < 0.01)，其峰值在40 min左右，且有明顯的劑量依賴性(圖2)，其I相ED50為4.17 μg(CI95為0.05 ～ 5.29 μg)，Ⅱ相ED50為2.58 μg(CI95為0.51 ～ 3.64 μg)。
2.3 混合給藥抗炎癥痛作用
鞘內(nèi)混合給藥1/16 ED50組(七葉皂苷1 μg +可樂定 0.2 μg)和1/8 ED50組(鞘內(nèi)七葉皂苷2 μg +可樂定 0.4 μg)組對Ⅰ、Ⅱ相痛均無明顯抑制作用;鞘內(nèi)1/4 ED50組(七葉皂苷4.2 μg +可樂定 0.7 μg)對Ⅱ痛有抑制作用(P < 0.01)，但對Ⅰ相痛無作用;鞘內(nèi)1/2 ED50組(七葉皂苷8.4 μg + 可樂定 1.3 μg)對Ⅰ、Ⅱ相痛均有明顯的抑制作用(P < 0.05和P < 0.01)，其峰值出現(xiàn)在35 min左右(圖3)，兩種藥物合用對Ⅱ相痛抑制作用的實驗ED50分別為：七葉皂苷3.17 μg (CI95 2.17 ～ 4.18 μg)、可樂定0.49 μg (CI95 0.34 ～ 0.65 μg);理論(相加作用) ED50為：七葉皂苷8.35 μg (CI95 5.71 ～ 10.00 μg)、可樂定1.29 μg (CI95 0.88 ～ 1.70 μg)醫(yī).學(xué).全.在.線52667788.cn。
因七葉皂苷單獨用藥對Ⅰ相痛無明顯抑制作用，我們未能對混合用藥時Ⅰ相炎癥痛的作用進(jìn)行進(jìn)一步定量分析。等輻射分析法顯示混合用藥時，抑制Ⅱ相炎癥痛的實際ED50在理論ED50下方，且不與理論ED50的95%置信區(qū)間連線相重疊，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)差異(圖4)，表明七葉皂苷和可樂定混合用藥對甲醛炎癥痛(Ⅱ相)有協(xié)同抑制作用醫(yī).學(xué).全.在.線52667788.cn。
