| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1786164A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2006.06.14 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510019706.3 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.11.01 |
| 專利名稱 | 一種重組人tPA的制備方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/09(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 武漢大學(xué);武漢陸地生物工程有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 葉林柏;吳正輝;佘應(yīng)龍;葉 力;郜金榮 |
| 地址 | 430072湖北省武漢市武昌珞珈山 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 武漢宇晨專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 王敏鋒 |
| 國(guó)省代碼 | 湖北;42 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種重組人tPA的制備方法，它包括下列步驟： A、利用工程菌株BL21/rtPAm-1，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)重組tPA，工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，CCTCCM205112，利用工程菌株BL21/rtPAm-1發(fā)酵生產(chǎn)重組人tPA包括步驟：首先是斜面種子培養(yǎng)：用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18-20小時(shí)；其次是瓶搖種子制備：用2YT培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12-14小時(shí)；第三是發(fā)酵培養(yǎng)：用發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)； B、tPA包涵體的提取和純化： 離心收集菌體，超聲波破碎菌體，離心去上清，沉淀用pH8.0的Tris-NaCl-吐溫-20和純凈水各洗滌三次； C、包涵體的溶解和變性： 按5-10克tPA濕重/升的量將tPA包涵體加到7-8M尿素中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至9-10，加入還原劑β-巰基乙醇至10-20mM，28-32℃攪拌溶解0.5-1小時(shí)，進(jìn)行溶解和變性； D、tPA復(fù)性，其方法如下： (a)加水將變性液稀釋一倍，使尿素濃度降至4M以下，tPA開(kāi)始復(fù)性； (b)用G50Sephadex分子篩柱層析逐漸去除復(fù)性液中的尿素和還原劑β-巰基乙醇，使tPA逐步復(fù)性，同時(shí)又去除分子量30kD以下的雜蛋白； (c)將收集的tPA溶液用pH8.0的10mM-20mMTris-Cl進(jìn)行稀釋，至tPA濃度為1-2克濕重/升，在20-25℃及pH8.0的條件下，放置16-24小時(shí)，進(jìn)行進(jìn)一步復(fù)性； E、柱層析純化和濃縮： (a)用Q-Sepharose4FF柱分離復(fù)性正確和復(fù)性不正確的tPA蛋白，柱子先用0.5MHCl進(jìn)行預(yù)處理，再用水洗至pH5.0-6.0，然后用2倍體積的pH8.0-8.5的20mMTris-Cl進(jìn)行平衡，復(fù)性液經(jīng)過(guò)濾后，加入pH8.0的Tris-Cl至20mM，上柱，用pH7.5的10mMTris-Cl，0.1-0.5MNaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集有活性的tPA洗脫峰，或用pH7.5的10mMTris-Cl，0.15-0.2MNaCl洗脫雜蛋白，再用pH7.5的10mMTris-Cl，0.25-0.35MNaCl洗脫有活性的tPA； (b)進(jìn)一步用疏水層析柱Phenyl-Sepharose6FF對(duì)tPA進(jìn)行純化，柱子用pH6.5-7.5的5mMTris-Cl，0.4-0.6MNaCl進(jìn)行平衡，在Q-Sepharose4FF柱洗脫的tPA液中加入NaCl至0.4-0.6M，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5，上柱，用pH8.0-9.0的2.5-5mMTris進(jìn)行洗脫，收集有活性的tPA； (c)用膜濾器對(duì)tPA洗脫液進(jìn)行濃縮，至tPA濃度3×105IU/ml； F、tPA冷凍干粉針劑制備： 采用冷凍干燥法將濃縮的tPA溶液制成冷凍干粉制劑。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人tPA的制備方法，包括了從工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)，tPA包涵體的提取、復(fù)性、純化、濃縮，到tPA產(chǎn)品的冷凍干粉制備等的全套生產(chǎn)工藝，其中重點(diǎn)解決了tPA包涵體的復(fù)性、tPA純化等關(guān)鍵技術(shù)。利用本發(fā)明所提供的制備方法，從10L發(fā)酵體積中可生產(chǎn)tPA晶體濕重10克以上，變性、復(fù)性后總活性可高達(dá)3-4×108IU，總的復(fù)性效率＞10％，復(fù)性后有活性tPA的回收率達(dá)到60％，純化后tPA的純度達(dá)99％以上。本發(fā)明提供的tPA制備方法具有產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、效率高的優(yōu)點(diǎn)，所提供的生產(chǎn)工藝可很快轉(zhuǎn)化為工業(yè)化生產(chǎn)工藝。 |
| 國(guó)際公布 |
