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公開(公告)號(hào)
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CN1276081C
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公開(公告)日
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2006.09.20
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200510048965.9
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申請(qǐng)日期
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2005.01.13
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專利名稱
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重組人aFGF在家蠶體內(nèi)基因工程表達(dá)生產(chǎn)的方法
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主分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/866(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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浙江大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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吳小鋒;曹翠平;姚慧鵬
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地址
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310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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杭州求是專利事務(wù)所有限公司
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代理人
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林懷禹
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國(guó)省代碼
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浙江;33
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主權(quán)項(xiàng)
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重組人aFGF在家蠶體內(nèi)基因工程表達(dá)生產(chǎn)的方法，其特征在于：(1)人aFGF基因的克隆：以人腦cDNA為模板，PCR基因擴(kuò)增技術(shù)獲得人aFGF基因，引物設(shè)計(jì)如下：正向引物：5′-AGATCTTTTAATCTGCCTCC-3′，含有BglII酶切位點(diǎn)；反向引物：5′-AGATCTTTAATCAGAAGAGAC-3′，含有BglII酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下：一個(gè)循環(huán)，94℃模板變性50秒；30個(gè)循環(huán)，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后1個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用PCR純化試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆入3.9kb載體pCR2.1，獲得pCR2.1-aFGF，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆人aFGF基因順序正確性；(2)含有人aFGF基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶BglII消化pCR2.1-aFGF得到人aFGF基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67b獲得重組體pAcGP67b-aFGF；通過共轉(zhuǎn)染在昆蟲細(xì)胞內(nèi)與雜交桿狀病毒HyNPVDNA同源重組產(chǎn)生重組病毒，共轉(zhuǎn)染的方法為：1μgpAcGP67b-aFGFDNA和15μgHyNPVDNA混合，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl，將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞；先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒原液，用來篩選重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml，將此重組病毒命名為HyNPV-aFGF；(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組人aFGF純化：使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前將幼蟲浸在冰水浴中進(jìn)行短時(shí)間麻醉，然后采用皮下注射的方法注射重組病毒懸浮液，濃度為106pfu/ml，每條家蠶注射20μl，注射1小時(shí)后喂桑，并在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后72-96小時(shí)內(nèi)收集家蠶幼蟲，解剖感染家蠶的脂肪體，并用此作為純化重組人aFGF的起始材料；將脂肪體勻漿后溶解在預(yù)冷的pH7.6，20mMTris-HCl緩沖液中，經(jīng)高速離心后將上清液直接上肝素Heparin親和層析柱，由于人aFGF與肝素具有強(qiáng)烈的親和性而使人aFGF結(jié)合到層析柱上，然后用含有0.4MNaCl的上述同樣緩沖液洗脫去掉雜蛋白，最后用2.0MNaCl的緩沖液一步洗脫出結(jié)合的人aFGF，通過SDS-PAGE電泳分析鑒定重組蛋白，結(jié)果顯示獲得的重組人aFGF純度很高；(4)重組人aFGF活性分析鑒定：用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC分析重人aFGF的生物活性：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC在培養(yǎng)基199中37℃培養(yǎng)，補(bǔ)充5％的CO2，培養(yǎng)基中另外添加100units/ml青霉素、100units/ml鏈霉素、4.0mg/ml兩性霉素B、20％熱滅活補(bǔ)加牛血清、5units/ml肝素和50mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物質(zhì)ECGS；上述細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于24孔組織培養(yǎng)板，細(xì)胞密度大約為1.0×104cells/well，每孔加1ml同樣的培養(yǎng)基；24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為含有10％SCS和5units/ml肝素、但是不含有ECGS的新鮮培養(yǎng)基199；純化的重組人aFGF經(jīng)梯度稀釋后用0.22μm滅菌過濾器過濾滅菌，加入到上述培養(yǎng)板孔中，每孔體積不超過10μl；72小時(shí)后，用PBS洗兩次，用胰蛋白酶消化后離心收集上述細(xì)胞，重懸于200μlPBS中；0.4％臺(tái)酚藍(lán)染色后，用血球計(jì)計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)；結(jié)果表明，重組人aFGF能夠刺激上述細(xì)胞的分裂、增殖，表明家蠶幼蟲中表達(dá)的重組人aFGF具有生物學(xué)活性。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子人aFGF在家蠶體內(nèi)基因工程表達(dá)生產(chǎn)的的方法。利用申請(qǐng)人構(gòu)建的AcNPV和BmNPV的雜交桿狀病毒HyNPV作為載體，構(gòu)建了含有人aFGF基因的重組病毒。利用家蠶作為重組病毒的宿主，表達(dá)了具有生物活性的重組人aFGF。解決了人aFGF在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)。利用親和層析從脂肪體中純化人aFGF，從每頭家蠶獲得的產(chǎn)量為600-700μg�；钚苑治霰砻�，重組人aFGF具有促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的生物活性。利用基因工程技術(shù)用家蠶作為表達(dá)載體可以大量生產(chǎn)重組人aFGF，為它在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。
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國(guó)際公布
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