|
公開(公告)號
|
CN1712547A
|
|
公開(公告)日
|
2005.12.28
|
|
申請(專利)號
|
CN200510037778.0
|
|
申請日期
|
2005.02.01
|
|
專利名稱
|
甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒
|
|
主分類號
|
C12Q1/68
|
|
分類號
|
C12Q1/68;C12Q1/25
|
|
分案原申請?zhí)? |
|
|
優(yōu)先權(quán)
|
|
|
申請(專利權(quán))人
|
合肥中科大生物技術(shù)有限公司
|
|
發(fā)明(設(shè)計)人
|
魏海明;田志剛;程 民;王宗貴
|
|
地址
|
230027安徽省合肥市金寨路96號科大西區(qū)生命科學學院
|
|
頒證日
|
|
|
國際申請
|
|
|
進入國家日期
|
|
|
專利代理機構(gòu)
|
合肥華信專利商標事務(wù)所
|
|
代理人
|
余成俊
|
|
國省代碼
|
安徽;34
|
|
主權(quán)項
|
甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征為：它包含細胞裂解液I、細胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II、無RNA酶的水、RNA分離柱、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液、PCR反應(yīng)液、探針、標準品、對照品；以上各種溶液所用溶劑均為水；(1)、細胞裂解液I包含0.1mol/LTris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L氯化鎂、水；(2)、細胞裂解液II包含3mol/L異硫氰酸胍、2mol/L鹽酸胍、0.3mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)、水；(3)、RNA洗滌緩沖液I包含0.2mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.1mol/L氯酸鈉、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(4)、RNA洗滌緩沖液II包含1.2mol/L檸檬酸鈉、0.5mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(5)、無RNA酶的水制備方法為：向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.05％(V/V)，室溫(22-25℃)放置10-12小時后，121℃，20min高壓，室溫放置備用。(6)、RNA分離柱是一種硅膠柱，可以特異性結(jié)合RNA，并可用水洗脫RNA，達到分離純化RNA的目的；(7)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含9.1μmol/LOligo(dT)12-18、3.6U/μlRnaseInhibitor、72.7mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)、182mmol/LTris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/LKCl、1lmmol/LMgCl2、水；(8)、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液包含20mmol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、100mmol/LNaCl、0.1mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidetp-40、200U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、水；(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽-水溶液，pH7.0-7.5，四種dNTP濃度均為10mmol/L；(10)、PCR反應(yīng)液包含18.5mmol/LTris-HCI(pH8.3，25℃)、2.78mmol/LMgCI2、92.6mmol/LKCl、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μlTaq酶、dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，其濃度均為400nmol/L)、水；上下游引物序列分別為：P1：5’-TGACTCCAGTAAACCCTGGT-3’P2：5’-AGAAATCTGCAATGACAGCC-3’(11)、探針為熒光標記探針，其序列為：5’-FAM-TGCTGCACTTCTTCATATGCCAACA-TAMRA-3’探針的濃度為：2μmol/L，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(12)、標準品的序列為：1AGAAATCTGCAATGACAGCCTCAAGTTGTTCCTCTGTTATTTGTGGCTTT51TGCTTCACAAGGTTAATGAGAAACTCTTGCTTCATCGTTTGCAGCGCTAC101ACCCTGAGCTTGGCACAGATCCTTATGGAAAATGAACTTGTCATCAGAGA151ATGCAGGAGGGACATATGTTTCATCCACCACCAAGCTGCTGAAGCATGGC201CTCCTGTTGGCATATGAAGAAGTGCAGCACTGGCCAACACCAGGGTTTAC251TGGAGTCA標準品的濃度為：106copies/μl，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(13)、對照品分為陽性對照品與陰性對照品，陽性對照品為有AFPcDNA的樣品(104copies/μl，TE溶解)，陰性對照品為正常人外周血總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
|
|
摘要
|
本發(fā)明涉及一種甲胎蛋白(AFP)mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含總RNA提取液(細胞裂解液I、細胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II和無RNA酶的水)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，dNTP混合物，逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR反應(yīng)液，探針，陽性標準品，對照品。本發(fā)明通過對新鮮抗凝外周血提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可準確定量檢測標本中AFP的mRNA的表達量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中檢測腫瘤患者的外周血、骨髓、淋巴結(jié)及癌組織中AFP mRNA的表達，為原發(fā)性肝癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療方案的確定及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。
|
|
國際公布
|
|
