| 公開(公告)號 | CN1221567C |
| 公開(公告)日 | 2005.10.05 |
| 申請(專利)號 | CN02134404.3 |
| 申請日期 | 2002.07.19 |
| 專利名稱 | 生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法 |
| 主分類號 | C07K14/435 |
| 分類號 | C07K14/435;C12N15/09;C12P21/02 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 廣州銘康生物工程有限公司 |
| 發(fā)明(設計)人 | 劉龍斌;楊琴;王敏榮;王軍志 |
| 地址 | 510730 廣東省廣州市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)友誼路173號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 廣州知友專利代理有限公司 |
| 代理人 | 邵毓琴 |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權(quán)項 | 生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，依次包括以下步驟：(1)定點突變天然t-PA獲得含突變位點的TNK-tPA突變體基因；(2)構(gòu)建表達載體pCdhfr；(3)以XhoI/XbaI雙酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的7Kb的DNA片段，與以XhoI/XbaI雙酶切的真核表達載體pCdhfr連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliJM109，以載體上的通用引物做PCR初步篩選克隆，取陽性克隆株培養(yǎng)，得到重組表達質(zhì)粒pCdhfr-mt-PA；(4)以TNK-tPA突變體表達質(zhì)粒pCdhfr-mt-PA轉(zhuǎn)染CHO-DHFR-細胞，經(jīng)克隆和篩選獲得高水平表達TNK-tPA的工程細胞株；(5)利用細胞培養(yǎng)生物反應器持續(xù)培養(yǎng)工程細胞，收集細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)分離純化獲得rhTNK-tPA突變體。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，該方法采用全長基因合成的方法合成含上述突變位點的TNK-tPA基因，在中國倉鼠卵巢細胞(CHO-DHFR-)中表達，經(jīng)克隆和篩選獲得高水平表達TNK-tPA的工程細胞株，利用細胞培養(yǎng)生物反應器持續(xù)培養(yǎng)工程細胞，收集細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)一系列柱層析分離純化技術，獲得rhTNK-tPA制品。本發(fā)明的目的基因在細胞中的表達水平高達18000IU/106cell/d，由此制備的rhTNK-tPA的單鏈比例高達80％以上，純度高達95％以上；對于工業(yè)化規(guī)模而言，本發(fā)明所需的設備相對比較簡單，成本低，工藝條件簡單。 |
| 國際公布 |
