| 公開(公告)號 | CN1197977C |
| 公開(公告)日 | 2005.04.20 |
| 申請(專利)號 | CN03119088.X |
| 申請日期 | 2003.05.19 |
| 專利名稱 | 一種同時(shí)檢測對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的核酸點(diǎn)雜交方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68;C12P19/34;G01N33/569 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中國科學(xué)院武漢病毒研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 石正麗;袁軍法 |
| 地址 | 430071 湖北省武漢市武昌小洪山 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 武漢宇晨專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 王敏鋒 |
| 國省代碼 | 湖北;42 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種同時(shí)檢測對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的核酸點(diǎn)雜交方法，包括下列步驟：(1)制備試劑盒：包括病毒核酸探針、樣品處理液、雜交液，封閉液、抗地高辛抗體、洗滌液、顯色劑、陽性對照、陰性對照、1.5ml離心管、雜交膜、雜交袋、研磨小棒；(2)探針的制備：地高辛探針和生物素探針的制備用常規(guī)PCR方法，將對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒PCR產(chǎn)物分別標(biāo)記上地高辛和生物素，擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)來自對蝦白斑綜合癥探針的序列，上游引物ACCACAATGACCGTAAGG；下游引物TGTACCTACAAGAGTGATTGG和托拉綜合癥病毒探針的序列，上游引物：AACGCGCATTGCTTCTTTT；下游引物：TCCTCCACTGGTTGTTGTAT；擴(kuò)增模板來自對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒核酸；(3)樣品處理：稱取樣品，放入1.5ml的離心管內(nèi)，加入樣品處理液，用研磨小棒研磨直至組織被研碎，調(diào)pH至7.5，低速離心后取上清，用TN緩沖液按1∶10稀釋，95℃處理10min并放置冰上；(4)預(yù)雜交和雜交：將雜交膜放入雜交袋內(nèi)，加入預(yù)雜交液使雜交膜被溶液覆蓋，封閉好雜交袋，在42℃預(yù)雜交1-4小時(shí)，然后雜交袋內(nèi)加入探針雜交液，42℃雜交過夜；(5)洗滌：將雜交膜放在干凈的平皿內(nèi)，用洗滌液在室溫條件下洗滌2次，將雜交膜重新放回干凈的雜交袋內(nèi)，加入洗滌液在68℃洗滌2次，每次15min；(6)封閉：棄洗滌液，加入1％封閉液，室溫下孵育30min；(7)抗體抗原反應(yīng)：用緩沖液稀釋抗地高辛抗體和生物素抗體，放入雜交袋內(nèi)，37℃下孵育30min；(8)洗滌：取出雜交膜放在干凈的平皿內(nèi)，用緩沖液在室溫下連續(xù)洗滌2次；(9)顯色：用緩沖液配置顯色底物，將雜交膜放在干凈的雜交袋內(nèi)，放入顯色底物覆蓋雜交膜，在避光處顯色，肉眼觀察結(jié)果，顯棕色為陽性反應(yīng)；(10)終止反應(yīng)：棄顯色液，加終止液，并以緩沖液漂洗，記錄結(jié)果；(11)再度顯色：用緩沖液配置顯色底物，將雜交膜放在干凈的雜交袋內(nèi)，放入顯色底物覆蓋雜交膜，避光顯色，肉眼觀察結(jié)果，僅感染W(wǎng)SSV為藍(lán)紫色，同時(shí)感染兩種病毒的陽性結(jié)果為棕色和藍(lán)紫色的疊加；(12)終止反應(yīng)：棄顯色液，加終止液，記錄結(jié)果。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的核酸點(diǎn)雜交方法，其步驟是：首先是探針的制備；其次是樣品處理；第三是預(yù)雜交和雜交；第四洗滌；第五是封閉；第六是抗體抗原反應(yīng)；第七是洗滌；第八是兩步顯色反應(yīng)；最后終止反應(yīng)。本發(fā)明能同時(shí)檢測兩種病毒，靈敏度高，成本低，適合于對蝦白斑綜合癥和托拉綜合癥病毒的診斷以及親蝦、幼苗和成蝦的健康狀態(tài)檢測。 |
| 國際公布 |
