| 公開(公告)號 | CN1526729A |
| 公開(公告)日 | 2004.09.08 |
| 申請(專利)號 | CN03151272.0 |
| 申請日期 | 2003.09.25 |
| 專利名稱 | 以疏水層析為主要手段的分離純化重組細(xì)胞色素P450bm-3的方法 |
| 主分類號 | C07K14/435 |
| 分類號 | C07K14/435;C07K14/47;C07K1/36 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 梅樂和;黃俊;姚善涇 |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 張法高 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項 | 一種以疏水層析為主要手段的分離純化重組細(xì)胞色素P450bm-3的方法，其方法步驟如下：1)硫酸銨分級沉淀用冷凍離心機(jī)將發(fā)酵液于0～20℃下以2000～10000rpm的速度離心8～15min，收集菌體，用冰水洗去培養(yǎng)基的雜質(zhì)，重懸于0.8～5M(NH4)2SO4、0.1M PMSF、0.1M EDTA、pH6～8的磷酸緩沖液中，用超聲波破碎儀在100～300W下破碎，然后以2000～10000rpm的速度離心8～30min，收集上清液，在上清液中加入20～40％飽和度的(NH4)2SO4沉淀，2000～10000rpm離心收集上清液，繼續(xù)在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的飽和度，2000～10000rpm離心收集沉淀，將沉淀重懸于0.8～5M(NH4)2SO4、0.1M PMSF、0.1M EDTA、pH6～8的磷酸緩沖液中，2000～10000rpm離心10～30min收集上清液，于0～20℃保存?zhèn)溆谩?)疏水層析分離用層析系統(tǒng)將保存的上清液以15～60cm/h的線速度加入層析柱中，用含有0.2～2M(NH4)2SO4、10～200mM、0.1M PMSF、pH6～8的磷酸緩沖液以相同的線速度洗滌至波長為280nm時的紫外吸收峰為零，再用不含(NH4)2SO4相同的磷酸緩沖液線性梯度洗脫，用紫外檢測儀在波長為280nm、417nm進(jìn)行檢測。收集含P450bm-3的活性峰洗脫液，洗脫液于0～10℃條件下保存?zhèn)溆谩?)凝膠層析分離用層析系統(tǒng)將疏水層析分離得到的活性洗脫峰收集液以10～100cm/h的線速度加入凝膠層析柱中，用10～200mM的磷酸緩沖液以相同的線速度洗滌至出峰完畢，用紫外檢測儀在波長為280nm和417nm進(jìn)行檢測，收集保留體積為9～12ml處的洗脫液，收集液體積為3～5ml。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種以疏水作用層析為主要手段的分離純化重組細(xì)胞色素P450bm-3的方法。它的純化步驟由粗酶液的制備、疏水層析和凝膠層析組成，其中在工程菌發(fā)酵中，將保存的表達(dá)P450bm-3的大腸桿菌經(jīng)種子培養(yǎng)基活化、發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，細(xì)胞色素P450bm-3在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；在粗酶液的制備時，將發(fā)酵培養(yǎng)基離心收集菌體，超聲波破碎菌體，離心后取上清液，然后進(jìn)行(NH4)2SO4分級沉淀，再用含(NH4)2SO4的緩沖液復(fù)溶；在疏水層析分離時，將復(fù)溶液加到疏水層析柱中進(jìn)行吸附，收集含P450bm-3的洗脫峰；最后通過凝膠層析分離，將收集的洗脫液加入凝膠層析柱中，收集含P450bm-3的活性洗脫峰，純度達(dá)到90％以上，活性回收率13.5％，純化倍數(shù)13.7，本發(fā)明具有作用條件溫和、成本低、工藝簡單、操作方便、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點。 |
| 國際公布 |
