氨�；D運核糖核酸合成酶識別型蛋白芯片的制備方法
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公開(公告)號
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CN1485434A
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公開(公告)日
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2004.03.31
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申請(專利)號
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CN02139106.8
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申請日期
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2002.09.26
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專利名稱
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氨�；D運核糖核酸合成酶識別型蛋白芯片的制備方法
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主分類號
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C12Q1/48
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分類號
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C12Q1/48
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權
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申請(專利權)人
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中國科學院武漢病毒研究所
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發(fā)明(設計)人
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謝斌;孟慶來;謝衛(wèi)紅
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地址
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430071湖北省武漢市武昌小洪山
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構
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武漢科宏專利事務所
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代理人
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王敏鋒
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國省代碼
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湖北;42
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主權項
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一種氨酰基轉運核糖核酸合成酶識別型蛋白芯片的制備方法，包括下列步驟：A、制備熒光物質IAEDANS標記的轉運核糖核酸；B、把精氨酰轉運核糖核酸合成酶基因和strep-tag序列進行基因重組，并合成精氨酰轉運核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白，回收后用液閃記數(shù)儀來檢測其活力；C、向表面修飾有親和素的芯片樣孔中加入反應試劑，使其終濃度為精氨酰轉運核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白50到100nmol/L，氯化鈉為150nmol/L，乙二胺四乙酸鈉為1mmol/L，在PH8.0，20℃條件下溫浴20分鐘，使精氨酰轉運核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白固定到芯片表面，再用無菌水清洗，4℃晾干；D、向固定化精氨酰轉運核糖核酸合成酶的樣孔中加入反應試劑，使其終濃度為Tris/鹽酸50mmol/L，氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L，熒光IAEDANS標記的精氨酸轉運核糖核酸534μmol/L，在PH7.4，37℃下溫浴5到7分鐘，使精氨酸轉運核糖核酸分子均勻而穩(wěn)定的結合到精氨酰tRNA合成酶上，后用氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片表面，4℃晾干；E、向步驟D中制備的精氨酰轉運核糖核酸合成酶-精氨酸轉運核糖核酸復合物中加入反應試劑，使終濃度為精氨酸0.1mmol/L，乙二胺四乙酸鈉為0.1mmol/L，氯化鉀80mmol/L，二硫蘇糖醇0.5mmol/L，在37℃，PH7.4條件下溫浴5分鐘后，停止反應，以氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片；F、把甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、洛氨酸、色氨酸、組氨酸、脯氨酸相應氨�；D運核糖核酸合成酶的基因都與strep-tag制成融合蛋白，再重復A、B、C、D、E的步驟在一塊芯片的20個孔中陣列固相出20種不同的氨�；D運核糖核酸合成酶-轉運核糖核酸復合物，制成氨�；D運核糖核酸合成酶識別型芯片。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種氨�；D運核糖核酸(tRNA)合成酶識別型蛋白芯片的制備方法，它適用于蛋白質中基本氨基酸組分的檢測。其特征在于將組成蛋白質的20種基本氨基酸對應的氨酰基轉運核糖核酸合成酶(AARS)以陣列形式固定到芯片表面，再在一定條件下把20種熒光標記的轉運核糖核酸固定到相應的合成酶上去，形成轉運核糖核酸-氨�；D運核糖核酸合成酶芯片。該芯片就可利用氨酰基轉運核糖核酸合成酶對其相應氨基酸的特異識別作用來檢測該種氨基酸在蛋白質中存在與否。最后綜合20個樣孔的反應情況，應用熒光掃描可檢測出蛋白質中氨基酸的組成。本發(fā)明具有準確，靈敏，快速，方便的特點。
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國際公布
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