豬圓環(huán)病毒2型與豬附紅細胞體混合感染的診斷與防治
豬圓環(huán)病毒2型與豬附紅細胞體混合感染的診斷與防治
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豬圓環(huán)病毒2型與豬附紅細胞體混合感染的診斷與防治稅光偉 韓旭 張成偉 洪洋 魏攀 指導(dǎo)老師：趙光偉西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，榮昌 402460摘要:隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的提高，生豬和種豬跨地域運輸越來越頻繁，使得豬群傳染病的發(fā)生越來越復(fù)雜。在很多豬場，都同時存在多種病原的混合感染。2009年1月四川隆昌某豬場送檢病豬3頭。該場中部分豬只陸續(xù)發(fā)生高熱、皮膚發(fā)紺、呼吸困難等癥狀，病程一般持續(xù)5～7天，發(fā)病豬一般以死亡為轉(zhuǎn)歸。不同年齡段的豬群中均有不同程度的發(fā)生，臨床表現(xiàn)基本相似。通過臨床癥狀和病理剖檢，疑似豬藍耳病病毒（PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2)、豬附紅細胞體（E.suis)混合感染。據(jù)此筆者在西南大學榮昌校區(qū)動物疾病快速診斷中心做了確診實驗。關(guān)鍵詞:圓環(huán)病毒2型 附紅細胞體 混合感染 綜合防治 Diagnosis and Treatmentof Porcine circovirus type 2 mixed infection Eperythrozoon Shui Guang WeiSouthwest China Normal University of Rongchang campus veterienary medicine department, Rongchang 402460, ChinaAbstract: Along with our country pig-breeding industry intensification degree's enhancement, the live pig and the kind of pig cross region transportation is getting more and more frequent, causes the pig group infectious disease's occurrence to be getting more and more complex. In many pig farms, simultaneously has many kinds of causes of disease the mixed infections. In January, 2009 Sichuan Longchang one pig farm deliver examines the sickness pig 3 heads. This partial pigs only one after another have symptoms and so on high fever, skin cyanosis, scant of breath, the course continue generally for 5~7 days, the morbidity pig take die generally as the extension turn over. In the disparity in age section's pig group has the varying degree occurrence, clinical manifestation basic similar. Split through the clinical symptoms and the pathology examine, I doubt that the sickness pigs mixed infection with PRRSV virus、PCV-2 virus 2 and E.suis. According to this,We decide to finish it in the southwest university of Rongchang campus animal disease fast diagnostic center.Key word: Porcine circovirus type 2 Eperythrozoon Mixed infection Integrated Control1 材料與方法1．1Bio-Rad PCR儀、菲恰爾（GL-16A)離心機、JUNYI紫外燈（JY04S-3C)、蘇靜安泰超凈工作臺、Pipet.Lite微量可調(diào)移液器等。所有實驗均在西南大學榮昌校區(qū)動物疾病快速診斷中心進行。1．2豬圓環(huán)病毒（PCV)核酸擴增檢測試劑盒、豬藍耳病病毒（PRRSV)核酸擴增檢測試劑盒均購自北京索奧生物技術(shù)有限公司。2 臨床癥狀2．1病豬體溫41～42℃，稽留熱、精神沉郁、皮毛粗亂、心跳和呼吸加快、雙側(cè)性
震顫，耳部、腹下、腹股溝、四肢出現(xiàn)不規(guī)則的
紫斑，指壓不褪色，有較濃的眼屎、眼
結(jié)膜蒼白、厭食或不食、呼吸困難、后軀無力、行走搖擺，病豬初期
便秘，呈糞球狀，小便深黃色，發(fā)病后期下痢和便秘交替出現(xiàn)。3 病料采集 對瀕死期的或剛剛死亡的豬進行仔細剖檢，無菌操作下分別采集心血、肝、脾、腎等病料，供實驗室檢測用。4 細菌學檢查 4．1血液壓片 取抗凝血或鮮血一滴，加3－4倍生理鹽水稀釋，蓋上蓋玻片，1000倍油鏡下觀察，可見大多數(shù)紅細胞邊緣呈鋸齒狀、星芒狀或不規(guī)則狀，并有微微顫動，即可診斷為附紅細胞體感染陽性。判定標準:在油鏡下檢查20個視野，有25個以下附紅細胞體的為感染+，有25－50個附紅細胞體的為感染++，有50－70及70以上個附紅細胞體的為感染+++。4．2組織涂片 將無菌采取的肝、脾、腎及淋巴結(jié)涂片，革蘭氏染色鏡檢。5 PRRSV和PCV－2的PCR檢測5．1核酸提取 病料RNA和DNA的提取分別用Trizol reagents(RNA提取液)和核酸提取液B（DNA)提取，按照說明書提供的方法進行。首先將血清稀釋，取100ul釋出血清加入500ul Trizol reagents（RNA提取液)充分震蕩，混勻后室溫放置5min。加入100ul氯仿，用力振蕩15s，室溫靜置10min，4℃13，000 rpm離心5min。小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈的離心管，加入等體積的異丙醇，充分混勻，13，000 rpm離心5min。棄上清，加入75％DEPC
乙醇，充分混勻，13，000 rpm離心5min，小心吸去大部分乙醇。將提取管口敞口在室溫空氣中干燥5min，待乙醇揮發(fā)干凈，用20ul DEPC H2O溶解沉淀。5．2逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)標本數(shù)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管，取2ul上述獲得的RNA并加入7ul PRRSV－SM RT MIX引物進行逆轉(zhuǎn)錄。PRRSV 逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)條件為：30℃5min，42℃45 min后98℃5min滅活轉(zhuǎn)錄酶。PCV－2 PCR檢測則省去RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄步驟，直接進行相應(yīng)的擴增。5．3擴增PCR PRRSV PCR擴增的反應(yīng)體系為25ul。PRRSV PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃變性2min,93℃→2min，93℃ 30 s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35個循環(huán)；PCV-2 PCR擴增反應(yīng)條件為：93℃→2min，后93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35個循環(huán)。5．4電泳檢測 取15ul PCR擴增產(chǎn)物直接用加樣槍點樣于2％瓊脂糖凝膠膠孔中，以5 v/cm電壓，1 x TAE中電泳20min后，紫外燈下觀察結(jié)果。用DL2000 Marker作為參照。PRRSV和PCV－2的陽性擴增帶分別為396bp和143bp。6 結(jié)果6．1剖檢變化 瀕死期病豬的典型表現(xiàn)為：病豬尸體消瘦，不同程度的貧血和
黃疸，體表皮膚、粘膜黃染，血液稀薄呈水樣；皮下
水腫，呈黃白色；體表和腸系膜淋巴結(jié)充血、出血和水腫；淋巴結(jié)腫大4～5倍，切面外翻，尤以腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、氣管和支氣管淋巴結(jié)明顯，切面多汁呈黃色；肺部的病變主要是腫脹、間質(zhì)增寬，有散在的橡皮樣硬塊；肝臟變性且有輕微黃疸、腫大，呈黃棕色；脾臟腫大；腎臟水腫，顏色呈灰白色，覆蓋有小出血點。部分病
豬心肌變軟，
心包積液。6．2細菌學檢查結(jié)果 6．2．1血液壓片 1000倍油鏡下觀察，可見大多數(shù)紅細胞邊緣呈鋸齒狀、星芒狀或不規(guī)則狀,診斷為附紅細胞體感染陽性，標記為：+++,結(jié)果見圖2。6．2．3組織涂片 革蘭氏染色鏡檢，未見細菌。6．3電泳檢測結(jié)果：豬圓環(huán)病毒（PCV－2)為陽性；藍耳病病毒（PRRSV)檢測為陰性。結(jié)果見圖1。 圖1 PCV-2和PRRSV PCR檢測結(jié)果 圖2 血液壓片油鏡觀察M：DL2000 Marker；1：PCV-2 PCR產(chǎn)物；2：PRRSV PCR產(chǎn)物7 防治措施7．1該病目前尚無疫苗預(yù)防，改進飼養(yǎng)管理，對發(fā)病嚴重的病豬立即淘汰，發(fā)病輕微的豬進行隔離治療。用2％ ～3％的燒堿對豬舍進行徹底消毒，保持豬舍飼養(yǎng)用具的清潔衛(wèi)生；切斷附紅細胞體病的傳播途徑。給予全價飼料增加機體的抗病能力，減少不良應(yīng)激的發(fā)生。改進飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激是控制繼發(fā)感染的關(guān)鍵。特別是仔豬斷奶后的3～4周是預(yù)防該病最關(guān)鍵最有效的時期，要降低飼養(yǎng)密度，盡量減少豬群的應(yīng)激因素，做好豬瘟、豬偽
狂犬病、豬細小病毒病、豬藍耳病疫苗的接種工作，做好豬群平時藥物預(yù)防工作，母豬在產(chǎn)前1周和產(chǎn)后1周在飼料中可添加土霉素等抗菌藥物，仔豬在斷奶前1周至斷奶后1個月在飼料中可添加強力霉素等抗菌藥，同時也拌料一些有預(yù)防作用的中藥，如清溫
敗毒散進行預(yù)防，以減少該病在豬群中流行。7．2豬圓環(huán)病毒是豬的免疫抑制性疾病，引起和繼發(fā)感染的疾病已成為世界養(yǎng)豬業(yè)的大敵。目前仍無有效防治措施，采取的方法是控制繼發(fā)感染，特別要加強斷奶仔豬的營養(yǎng)和管理，采取藥物預(yù)防，降低豬群死亡率，減少經(jīng)濟損失。7．3對癥治療 7．3．1治療圓環(huán)病毒病目前尚無特效的治療藥物，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，早確診，早治療。對發(fā)病不嚴重的豬只，選用新型的抗病毒劑如干擾素、白細胞介導(dǎo)素、免疫球蛋白、
轉(zhuǎn)移因子等進行治療；同時采用
黃芪多糖注射液并配合Vb1、Vb12、Vc肌肉注射，增強豬自身免疫力；另外，也要采用抗菌藥物，控制繼發(fā)感染，如氟苯尼考、
阿米卡星、鹽酸林可壯觀霉素等配合治療，盡量少用磺胺類藥物和
地塞米松進行治療。7．3．2目前對豬附紅細胞體病療效較好的藥物有長效土霉素，
四環(huán)素，貝尼爾等，按說明劑量肌注24h后，可見臨床癥狀改善，連用3～5d。另外，對陽性豬群的貧血豬，可應(yīng)用鐵制劑(
右旋糖酐鐵)、土霉素、Vb12、VC等對癥治療。8 小結(jié)與討論8．1此次疫病根據(jù)
流行病學、臨床癥狀和剖檢變化及實驗室診斷，最后確診為豬圓環(huán)病毒2型與附紅細胞體混合感染。8．2豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒感染所引起的以免疫抑制為特征的一類病毒性傳染病。PCV-2感染新生仔豬及斷奶仔豬，使仔豬發(fā)生先天性震顫和斷奶后全身消耗性綜合征，是一種慢性消耗性疾病，導(dǎo)致斷奶仔豬生長緩慢、發(fā)育障礙、機體免疫力下降、易繼發(fā)其他疾病(附紅細胞體病、弓形體病、豬瘟等)而加重病情。要抓住關(guān)鍵時期，減少應(yīng)激，仔豬斷奶后3～4周，是預(yù)防圓環(huán)病毒的最關(guān)鍵時期，最有效的方法和措施是盡可能減少斷奶仔豬的應(yīng)激。經(jīng)分析，豬長途販運，使動物機體產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)，加上抵抗力下降，特別是感染附紅體和弓形體病后，進一步降低機體的免疫力，當遇到傳染性疾病流行時，特別是遇到豬圓環(huán)病毒感染侵襲，就會造成病豬死亡率增高。8．3豬附紅細胞體病是由豬附紅細胞體引起豬的一種血液病，蚊蟲是重要的傳播媒介，尤其在多雨季節(jié)蚊蟲易孳生，加上豬群感染圓環(huán)病毒，機體抵抗力下降，而發(fā)生豬附紅細胞體病。防治該病應(yīng)消滅蚊蟲，切斷傳播途徑，加強
器械的消毒，提高管理水平。從現(xiàn)在的季節(jié)來看，正是春季，氣溫時高時低，忽熱忽冷，春季又是病菌活動頻繁季節(jié)，所以加快了疫病流行。另外，
老鼠可傳播多種疾病，若鼠害控制不力，則易引起疾病的發(fā)生，因此，必須控制鼠害。8．4為了減少疾病的發(fā)生，規(guī)�；B(yǎng)豬場必須堅持自繁自養(yǎng)，做到全進全出，加強平時消毒工作，這樣盡可能地避免或減少疫病的傳入和流行。8．5附紅細胞體病的死亡率很低，但與豬圓環(huán)病毒混合感染后，死亡率就會顯著上升，可達60％以上，這也是造成病豬死亡率增高的重要原因。采用綜合措施后，該豬場的病情基本穩(wěn)定，得到了有效控制，到2月下旬逐漸恢復(fù)正常。參考文獻：[1] 馬其國,商紹彬,申會剛. 豬圓環(huán)病毒2型診斷技術(shù)的研究進展[J]. 浙江畜牧獸醫(yī), 2008, 33(5): 7-9.[2] 谷訓(xùn)國. 豬附紅細胞體病的鑒別診斷與防治[J].2008,(6): 81.[3] 蘇雙,呂雪峰. 豬附紅細胞體病研究進展[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊,2008,(8): 25-27.[4] 孫波,王俊珍,竇續(xù)鑫. 豬附紅細胞體病的診治[J]. 湖北畜牧獸醫(yī),2007,(2): 39-40.[5] 劉殿忠. 豬圓環(huán)病毒與附紅細胞體混合感染的診治[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，2008,(3): 43[6] 金升藻，金巍，李鵬. 豬圓環(huán)病毒與豬附紅細胞體混合感染的診斷與防治[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2OO7,35(22)：6796—6797.[7] 辛曉星,楊麗萍,張君. 豬附紅細胞體病的診治[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息,2008,(8): 80.[8] 李世江,馬開剛,辛光英,于媛媛. 豬圓環(huán)病毒病的診斷與防治對策[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，2005,(5): 22-23.[9] 蔡泉,霍翠梅,吳利鋒. 豬藍耳病的RT-PCR診斷報告[J]. 山東畜牧獸醫(yī)，[10] 劉明壽. 附紅細胞體病的病原學及診斷學研究進展[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2003，25(6)：674～678.[11] Kabay M J，Richard R B．Ellis T E．Acrossectional study to showEperythrozoon ouis infection is prevalent in westem Australian sheep farms [J]．Aust Vet J，1991，68:170—172.[12]Nicholls J I，Veale P I．The prevalence of Eperthrozoon ouis in—fection on weanling and adult sheep in north easterm Victoria[J]．Aust Vet J，1986，63：118—120．[13]Messick J B，Cooper S K，Huntley M．Development and evalu—ation of polymerase chain reaction assay using the 16S rRNA gene for detection of Eperythrozoon suis infection [J]．J Vet Diagn Invest，1999，11(3)：229—236．[14] 王宏，金擴世，馬嗚嘯. 豬藍耳病和圓環(huán)病混合感染的診斷與防治[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2007,28(10): 32-33.[15] 李繼超,徐克發(fā),冉宇生,向紹平. 豬藍耳病的診治[J]. 畜牧市場,2008, (8)：65-66.[16] 王芳,鄢珣,韓慶彥. 豬2型圓環(huán)病毒PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī), 2008,38(4): 13-16.[18] 閻金龍,張志勇,易春玲. 圓環(huán)病毒與附紅細胞體混合感染的診治[J]. 吉林畜牧獸醫(yī), 2008, 29(4): 24-25.[19] 周鳳山,魏桂蘭,季燚,徐增強. 豬附紅細胞體病并發(fā)圓環(huán)病毒病的診治[J].畜禽業(yè),2008,(3): 85-86.[20] 何曉劍,韓建珍. 豬圓環(huán)病毒的防制[J]. 河南畜牧獸醫(yī),2008,29(10): 44-45.[21] 董信田,肖劍,金俊杰,金大春,王躍川. 豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法的建立[J]. 畜禽業(yè),2008,(90)：22-24.[22] 王林,王睿, 郭艷杰. 豬圓環(huán)病毒與附紅細胞體混合感染的診治[J]. 四川畜牧醫(yī),2005,32(4): 44-45.[23] PCR detection of porcine circovirus type 2 (PCV2) DNA in blood, tonsillar and faecal swabs from experimentally infected pigs A. Caprioli[a]; F. McNeilly[b]; I. McNair[b]; P. Lagan-Tregaskis[b]; J.Ellis[c];S.Krakowka[d];J.McKillen[b]; F. Ostanello[a]; G. Allan[b] Research in Veterinary Science, Volume 81, Issue 2, October 2006, Pages 287-292．[24]The involvement of Fas/FasL interaction in porcine circovirus type 2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus co-inoculation-associated lymphocyte apoptosis in vitro Hui-Wen Chang[a]; Chian-Ren Jeng[a]; Chun-Ming Lin[a]; Jiuan Judy Liu[a][b]; Chih-Cheng Chang[c]; Yi-Chieh Tsai[a]; Mi-Yuan Chia[a]; Victor Fei Pang[a][d]&Email:pang@ntu.edu.tw ．Veterinary Microbiology, Volume 122, Issue 1-2, 16 May 2007, Pages 72-82．
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