豬流感病毒H1N1分離株HA基因的克隆與序列分析
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豬流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道傳染病。流感病毒屬于正黏病毒科，包括A、B、C、托高土病毒屬4個屬。A型流感病毒可以感染多種動物，包括許多禽類和哺乳動物。B型和C型病毒似乎只能從人體內(nèi)分離到，雖然也從豬體內(nèi)分離到了C型流感病毒，但感染豬的主要還是A型流感病毒。早在1918年，美國、匈牙利和中國就有關(guān)于豬流感的報道，這與1918年西班牙人類大流感的時間一致。目前該病呈世界分布，但主要以地方性流行為主。單純的SIV感染表現(xiàn)為發(fā)病率高(100%)。病死率低(約5%)的特點，其嚴(yán)重程度與流行毒株、豬的日齡和健康狀況、環(huán)境條件及細(xì)菌性繼發(fā)感染相關(guān)。豬流感不僅危害豬體健康，同時影響育肥豬的上市時間，并增加飼養(yǎng)成本，對養(yǎng)豬業(yè)造成的損失不容忽視。豬流感病毒不僅對豬體健康和養(yǎng)豬業(yè)危害大，在整個流感病毒的遺傳進(jìn)化和生態(tài)分布中都占有重要地位，特別是對人類健康具有潛在的威脅。雖然近年來發(fā)生了多起禽流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例，但一般認(rèn)為流感病毒具有種屬特異性，即禽流感病毒很難突破種間屏障直接感染人。2006年底，無錫某豬場發(fā)生不同程度的呼吸系統(tǒng)疾病，本研究對從該豬場分離的一株具有血凝特性的毒株H1N1，利用RT-PCR擴增HA基因。經(jīng)遺傳分析表明，該分離株屬古典型H1N1，極可能在人-畜-禽間相互傳播。1 材料與方法1.1 材料新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒H9N2、豬流感病毒H3N2、人源流感病毒PR8株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈。A/Swine/Wuxi/1/07(H1N1)病毒株分離于江蘇無錫地區(qū)某發(fā)病豬場鼻拭子樣品；SPF雞胚(9日齡)購自山東SPF雞胚孵化場。1.2 載體與主要試劑pGEM-T easy載體、T4 DNA連接酶、RT-PCR試劑盒購于美國Promega公司；凝膠回收DNA試劑盒購于德國QIAGEN公司；EcoRⅠ酶購自MBI公司。1.3 HA基因的擴增1.3.1 病毒RNA提取 通過SPF雞胚擴增上述病毒，收集尿囊液，經(jīng)濃縮后采用Trizol試劑提取各病毒RNA。吸取250 μL病毒液至1.5 mL用DEPC水處理過的Eppendorf管中，加入750 μL Trizol試劑，混勻后置15 ℃～30 ℃作用5min；加入0.2 mL的氯仿，用手劇烈搖15 s，室溫靜置5 min；于4 ℃ 以12 000 r/min離心15 min；取上清于另一個Eppendorf管中，加入500 μL的異丙醇，室溫作用10 min，于4 ℃以12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入750 mL/L的
乙醇1 mL漂洗2次；干燥后用DEPC水重懸，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?.3.2 分離株亞型鑒定 分別采用Choi等建立的鑒別H1和H3亞型的RT-PCR法對分離株進(jìn)行亞型鑒定。鑒別H1和H3亞型的兩套引物序列為：HF1：5′-GGGACATGTTACCCAGGAGAT-3′，HR1：5′-GCATTGTATGTCC AAATATCCA -3′，HF3：5′-TATGCCTGGTTTTCGCTCAA-3′，HR3；5′-TTCGGGATTACAGTTTGT TG-3′。第一套引物擴增片段長度為1 006 bp，為H1亞型特異性；第二套引物擴增片段長度為663 bp，為H3亞型特異性。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s,30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.3.3 HA的引物設(shè)計 根據(jù)已發(fā)表的
豬流感H1N1 HA序列設(shè)計上游引物P1：ATG AAA GCA AAA CTC CTG ATC CTG T；下游引物P2：CAG ATG CAT ATT CTA CAC TGC AAA，以尿囊液提取的RNA為模板擴增HA基因。1.3.4 HA全基因片段的RT-PCR 按Promega公司的AMV RT-PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行，反應(yīng)體積為25 μL。反應(yīng)混合物包括RNA模板5 μL，上下游引物各0.1 μmol/L，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2.5 U，Taq DNA聚合酶2.5 U，RNA酶抑制劑20 U，dNTP混合物1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L。進(jìn)行反應(yīng)時，首先逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50 ℃ 30 min，然后94 ℃ 2 min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，再進(jìn)行常規(guī)PCR。1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，分別利用QIAGEN公司凝膠回收試劑盒回收，與pGEM-T easy載體按1∶8(摩爾比)于4 ℃連接12 h，轉(zhuǎn)化DH5α，用AIX(含有0.1 mg/mL Amp， 0.1 mg/mL IPTG，0.02 mL X-gal)LB平板藍(lán)白斑篩選，提取白斑的質(zhì)粒DNA，用Eco RⅠ酶切鑒定，篩選陽性克隆。1.5 序列分析通過DNA Star軟件和BlastN軟件分析HA基因的遺傳特性，分析該分離株的遺傳背景和來源。
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做好管理和消毒
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消毒做好
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