動脈粥樣硬化:第三節(jié)　蛋白質濃度的測定

蛋白質溶液濃度測定方法有多種，下述幾種方法可供選用。蛋白質濃度的測定，往往用于計算純化方法的回收率的重要方法。

一、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，至令仍廣泛采用。在需www.med126.com要快速，但不很準確的測定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質提純的早期價段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu²⁺與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質緩沖液，如Tris、Good緩沖液等�？捎贸恋矸ǔ�去干擾物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質進行52667788.cn/yishi/定量測定。

二、Lowry法

此法是雙縮脲法的進一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應，即Cu⁺⁺與蛋白質在堿性溶液中形成絡合物，然后這個絡合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑)，結果得到深藍色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質溶液。其干擾物質與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質的存在會使結果嚴重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時要特別小心，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應只有在pH10時才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu^2+-蛋白質溶液中時，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2^+-蛋白質絡合物所還原。

三、紫外吸收法

大多數(shù)蛋白質在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個特異性吸收，可以計算蛋白質的含量。如果沒有干擾物質的存在，在280nm處的吸收可用于測定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質溶液。部分純化的蛋白質常含有核酸，核酸在260nm波長處有最大吸收。有核酸時，所測得的蛋白質濃度必須作適當校正，一般按下述公式粗略計算：

是蛋白質溶液在280nm波長處（光程1厘米)測得的光密度值。

是蛋白質溶液在260nm小波長處（光程1厘米)處所測得的光密度值。

此方程是從烯醇酶（在酵母核酸存在時)得出來的。因此，對其他蛋白質和其他核酸不一定適用。由于各種蛋白質所含芳香族氨基酸的量不同，因此，濃度為0.1%的各種蛋白質在280nm處的消光系數(shù)（

)在0.5～2.5之間變化。

所有的蛋白質在230nm以下都有強吸收。例如，牛血清白蛋白的α^0.1%在225nm和215nm處分別為5.0和11.7，而在280nm處測為0.58。在230nm以下的強吸收是由于肽鍵的存在，因此，此值對所有的蛋白質都是一樣的。從215nm和225nm處的光密度之差可用于測定濃度為10μl/ml～100μl/ml的蛋白質。蛋白質濃度可以近似地由下式得到：

光密度之差求

得，這一公式是減去溶液中非蛋白質成分產生的誤差。但是，蛋白質之間的分子量差異比較大，因此，在比較幾種蛋白質含量時，必須作適當?shù)男Ｕ�。由于蛋白質的吸收峰常因pH改變而變化，所以在制作標準曲線時，必須與樣品條件一致。

（吳翠華　賀小玲　周新)