臨床生物化學(xué):第三節(jié)　離心技術(shù)的應(yīng)用

離心技術(shù)（centrifugaltechnique)是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到一個(gè)外向的離心力的行為而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如分離出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物，天然的生物大分子、無機(jī)物、有機(jī)物，在生物化學(xué)以及其它的生物學(xué)領(lǐng)域常用來收集細(xì)胞、細(xì)胞器及生物大分子物質(zhì)。

一、基本原理的分類

（一)基本原理

⒈離心力（centrifugal force，F(xiàn)c)離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc)的大小等于離心加速度ω²X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。

⒉相對(duì)離心力（relative centrifugal force，RCF)由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。

RCF就是實(shí)際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec²)；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm)。

在上式的基礎(chǔ)上，Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對(duì)應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖，見圖16-4，在用圖16-4將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對(duì)離心力時(shí)，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來交于RCF標(biāo)尺，此交點(diǎn)500×g即是RCF值。

⒊沉降系數(shù)（sedimentation coefficient，s)根據(jù)1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動(dòng)的速度。

若ω用2πn/60表示，則

式中X₁為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X₂為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S實(shí)際上時(shí)常在10^-13秒左右，故把沉降系數(shù)10^-13秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。

⒋沉降速度（sedimentation velocity)沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。

式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρ_P為粒子的密度；ρ_m為介質(zhì)的密度。

從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項(xiàng)沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：

從該式中可看出，①當(dāng)ρ_P＞ρ_m，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρ_P＝ρ_m，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρ_P＜ρ_m，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。

⒌沉降時(shí)間（sedimentation time，Ts)在實(shí)際工作中，常常遇到要求在已有的離心機(jī)上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長時(shí)間可達(dá)到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時(shí)間來確定分離某粒子所需的時(shí)間。

根據(jù)沉降系數(shù)（S)式可得：

圖16-4　離心力的轉(zhuǎn)換列線圖

將左側(cè)r點(diǎn)與右側(cè)n點(diǎn)連成一條直線，與中間RCF相交的

點(diǎn)即為相對(duì)離心力(×g)RCF=1.118×10²×r×n²。

積分得

式中X₂為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X₁為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時(shí)間（t₂－t₁)用Ts表示則式可改為：

式中Ts以小時(shí)為單位，S以Svedberg為單位。

⒍K系數(shù)（k factor) K系數(shù)是用來描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個(gè)指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。

其中R_max為轉(zhuǎn)子最大半徑；R_min為轉(zhuǎn)子最小半徑。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個(gè)變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速廢，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時(shí)，K系數(shù)就改變了。通常，離心機(jī)的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計(jì)算出來的數(shù)值。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計(jì)沉降到管底所需的離心時(shí)間是T＝k/S＝4h，利用此公式預(yù)估的離心時(shí)間，對(duì)水平式轉(zhuǎn)子最適合；對(duì)固定角式轉(zhuǎn)子而言，實(shí)際時(shí)間將比預(yù)估的時(shí)間來得快些。

（二)分類

根據(jù)離心原理，按照實(shí)際工作的需要，目前已設(shè)計(jì)出許多離心方法，綜合起來大致可分三類。

⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離，包括差速離心法（differential velocitycentrifugation)和速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation)。

⒉等密度離心法（jsopycnic centrifugation)又稱等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。

⒊經(jīng)典式沉降平衡離心法用于對(duì)生物大分子分子量的測定、純度估計(jì)、構(gòu)象變化等。

二、離心分離方法

（一)差速離心法

它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。

差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

例如用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份

（二)速率區(qū)帶離心法

速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X₁)的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處（X₂)介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρ_P＞ρ_m。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機(jī)械振動(dòng)而引起已分層的粒子再混合。

由于ρ_P＞ρ_m可知S＞0，因此該離心法的離心時(shí)間要嚴(yán)格控制，既有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前。如果離心時(shí)間過長，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部；離心時(shí)間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

（三)等密度離心法

等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即ρ_m＞ρ_P時(shí)粒子上�。辉趶濏斕帵�_P＞ρ_m時(shí)，則粒子沉降，最后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即ρ_P＝ρ_m，此時(shí)dx/dt為零粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置www.med126.com。

此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時(shí)。常用的梯度液是CsCl。

（四)梯度溶液的制備

⒈梯度材料的選擇原則作為一種理想的梯度材料應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：①與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。③不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價(jià)格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對(duì)于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll)、右旋糖酐、糖原。②無機(jī)鹽類：CsCl（氯化銫)、RbCl（氯化銣)、NaCl、KBr等。③有機(jī)碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide)等。④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機(jī)物：如氟代碳等。

⒉梯度材料的應(yīng)用范圍

⑴蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達(dá)1.33g/ml，且由于價(jià)格低容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。

⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。

⑶氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。

⑷鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。

⑸Per52667788.cncoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP)，滲透壓低，它對(duì)生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。

三、分析性超速離心

與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場中的沉降過程。

（一)分析性超速離心的工作原理

分析性超速離心機(jī)主要由一個(gè)橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個(gè)柔性的軸聯(lián)接成一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時(shí)形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個(gè)冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納二個(gè)小室：分析室和配衡室。配衡室是一個(gè)經(jīng)過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個(gè)普遍水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下二個(gè)平面的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對(duì)紫外光的吸收（如對(duì)蛋白質(zhì)和DNA)或折謝率的不同對(duì)沉降物進(jìn)行監(jiān)視。后一方法的原理是：當(dāng)光線通過一個(gè)具有不同密度區(qū)的透明液，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一“峰”。由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。圖16-5是分析性超速離心系統(tǒng)的示意圖。

（二)分析性超速離心的應(yīng)用

⒈測定生物大分子的相對(duì)分子重量測定相對(duì)分子重量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應(yīng)用最廣的是沉降速度，超速離心在高速中進(jìn)行，這個(gè)速度使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動(dòng)，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個(gè)明顯的界面，該界面隨時(shí)間的移動(dòng)而移動(dòng)，這就是粒子沉降速度的一個(gè)指標(biāo)，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。

分子或粒子的相對(duì)分子重量則可從Svedberg方程式來確定：

圖16-5　分析性超速離心系統(tǒng)圖示

式中M：該分子不含水的相對(duì)分子重量；R：氣體常數(shù)；T：絕對(duì)溫度；S：分子的沉降系數(shù)；ν：分子的微分比容（當(dāng)一克溶質(zhì)加到一個(gè)大體積的溶液中所占有的體積)；ρ：溶劑的密度。

⒉生物大分子的純度估計(jì)靜分析性超速離心已廣泛地應(yīng)用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。用沉降速度的技術(shù)來分析沉降界面是測定制劑均質(zhì)性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認(rèn)為是均質(zhì)的，如有雜質(zhì)則在主峰的一側(cè)或二側(cè)出現(xiàn)小峰。

⒊分析生物大分子中的構(gòu)象變化分析性超速離心已成功地用于檢測大分子構(gòu)象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質(zhì)上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機(jī)溶劑)DNA分子可能發(fā)生一些構(gòu)象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構(gòu)象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實(shí)。