免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第四節(jié)　免疫濁度法

經(jīng)典的沉淀試驗(yàn)有4個(gè)缺點(diǎn)無(wú)法克服，即操作繁瑣、敏感度低（10～100μg/ml)、時(shí)間長(zhǎng)和難以自動(dòng)化。根據(jù)抗原與抗體能在液體內(nèi)快速結(jié)合的原理，70年代出現(xiàn)了微量免疫沉淀測(cè)定法，即免疫透射濁度測(cè)定、免疫膠乳濁度測(cè)定和免疫散射濁度測(cè)定法。這3種技術(shù)皆已常規(guī)用于臨床體液蛋白的檢測(cè)，并已創(chuàng)造出了多種自動(dòng)化儀器。

免疫濁度測(cè)定的基本原理是：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過(guò)量時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可計(jì)算出受檢物的含量。

免疫濁度測(cè)定法按照儀器設(shè)計(jì)的不同可以分為兩種，即比濁儀測(cè)定（turbidimetermeasure)和散射比濁儀測(cè)定（nephelomitermeasure)。比濁儀測(cè)定是測(cè)量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰減，其讀數(shù)以吸光度A表示。A什反映了入射光與透射光的比率（A＝2－log10^T，T代表濁度百分比)。散射比濁儀測(cè)定是測(cè)量入射光遇到質(zhì)點(diǎn)（復(fù)合物)后呈一定角度散射的光量，該散射光經(jīng)放大后以散射值表示。兩者的比較見(jiàn)圖12-12。

圖12-12透射光和散射光測(cè)定比較

由于免疫復(fù)合物52667788.cn/zhicheng/的形成有時(shí)限變化，當(dāng)抗原抗體相遇后立即結(jié)合成小復(fù)合物（＜19S)，幾分種到幾小時(shí)才形成可見(jiàn)的復(fù)合物（＞19S)。作為快速比濁測(cè)定，這種速度太慢，加入聚合劑（或促聚劑)可www.med126.com中速大的免疫復(fù)合物形成。目前促聚劑多用聚乙二醇（MW6000～8000)，濃度約為4％。

濁度測(cè)定亦有其弱點(diǎn)。其一是抗原或抗體量大大過(guò)剩時(shí)易出現(xiàn)可溶性復(fù)合物，造成測(cè)定誤差，測(cè)定單克隆蛋白時(shí)這種更易出現(xiàn)。其二是應(yīng)維持反應(yīng)管中抗體蛋白量始終過(guò)剩，這個(gè)值要預(yù)先測(cè)定，使儀器的測(cè)定范圍在低于生理范圍到高于正常范圍之間；其三是受血脂的影響，尤其是低稀釋度時(shí)，脂蛋白的小顆�？尚纬蓾岫龋�使測(cè)定值假性升高。

二、免疫膠乳濁度測(cè)定法

在上述比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較長(zhǎng)時(shí)間；如形成較大的復(fù)合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。于是發(fā)展了免疫膠乳濁度測(cè)定，其基本原理是：將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個(gè)膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過(guò)，兩個(gè)或兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過(guò)光減少，這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，當(dāng)然也與待測(cè)抗原量呈正比。見(jiàn)圖12-13。

圖12-13載體膠乳免疫比濁原理

（a)帶抗體的膠乳在波長(zhǎng)之內(nèi)可透過(guò)光線；（b)結(jié)合后，則形成光線衰減

該技術(shù)的關(guān)鍵在于兩個(gè)方面。首先是選擇適用的膠乳，其大�。ㄖ睆�)要稍小于波長(zhǎng)。用500nm波長(zhǎng)者，選擇100nm顆粒較適合；用585nm波長(zhǎng)者，則選用100～200nm顆粒為好。目前多用200nm的膠乳顆粒。其次，膠乳與抗體結(jié)合時(shí)用化學(xué)交聯(lián)雖好，但失活也較嚴(yán)重；一般用吸附法即可。

三、免疫速率散射濁度測(cè)定法

速率散射比濁法（ratenephelometry)是Sternberg（1977)創(chuàng)建的。光沿水平軸照射時(shí)，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物可導(dǎo)致光散射，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，亦即待測(cè)抗原越多，形成的復(fù)合物也越多，散射光就越強(qiáng)。

速率散射比濁測(cè)定是一種抗原抗體結(jié)合的動(dòng)態(tài)測(cè)定法。經(jīng)典的沉淀反應(yīng)皆在抗原抗體結(jié)合完成后進(jìn)行復(fù)合物的定性或定量測(cè)定（終點(diǎn)法)；若在抗原抗體反應(yīng)的最高峰（約在1min內(nèi))測(cè)定其復(fù)合物形成的速率（速率法)，則可達(dá)到快速、準(zhǔn)確的目的。