實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:附錄三　全血細(xì)胞培養(yǎng)染色體技術(shù)常用試劑配制

一、國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用試劑配制

（一)培養(yǎng)液

（1)RPMI1640培養(yǎng)液：稱取RPMI培養(yǎng)基9.8g，碳酸氫鈉1.9g、青霉素100u/ml，加雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)　pH7.2～7.4無菌過濾凍存?zhèn)溆谩?/p>

（2)小牛血清商品：成都生物制品廠。

（3)植物凝集素（PHA)：自制或成品（重慶藥檢所)。

（4)pH調(diào)整液：5%NaHCO₃溶液高壓滅菌（8磅15min)，0.1N稀鹽酸液100ml。

（5)秋水仙素：10mg/ml無菌過濾高壓滅菌（8磅10min)。

（6)磷酸緩沖液：pH7.4。

磷酸氫二鈉28.8g(H₂O)、磷酸二氫鉀2.67g(無水)，溶于1000ml雙蒸水中，加肝素，終濃度為100u/ml。

（7)Giemsa染色液：

Giemsa粉劑　1g

甘油66ml

在研缽中，加入少量甘油油仔細(xì)研磨然后放甘油全部加磨，60℃溫箱中保溫2h，冷卻后加入甲醇66ml。裝入有色瓶中混合待用。染色時(shí)用pH7.4磷酸緩沖液稀釋10倍，隨配隨用。

（二)固定液

（1)甲酸：冰乙酸3：1混合即用。

（2)PBS緩沖液配制：

NaCl 16gNa₂HPO₄(12H₂O)5.65g

KCl　0.4g 　KH₂PO₄0.4g

加雙蒸水至1000ml pH7.0。

取5%胰酶（生理鹽水配制)1ml加入50ml PBS液中（最終濃度為0.025%)，4℃冰箱待用。

二、細(xì)胞培養(yǎng)（Bhatl B和McGee JOD,1990)

1．完全培養(yǎng)基

RPMI76.0ml

胎牛血清 20.0ml

植物凝集素2.0ml

抗生素/抗菌素溶液（100×)1.0ml

L-谷氨酰胺（100×)　1.0ml

2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine,5’-溴-2-脫氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH₂O中，0.2μm濾膜過濾除菌，分裝后-20℃儲存，BudR要在柔光（弱光)下操作。

3．胸腺嘧啶（Thymidine,Thd)按250μg/ml溶解于dH₂O中，過濾后分裝儲存于-20℃。

4．Colcemid(Sigma)5.0μg/ml溶于dH₂O中，過濾后分裝儲存于-20℃。

5．KCl（0.75mol/L)溶解560mg于100ml dH₂O中，新鮮配制37℃保存。

6．固定劑甲醇冰醋酸按3：1（V/V)混合即可，現(xiàn)用現(xiàn)配，置冰上待用。

7．缺口平移試劑盒（Amersham和BRL公司)

8．生物素7-dATP(BRL)

9.糖原（BRL)

10．RNA酶A（Sigma)

（1)儲備液

稱取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸鈉中，置沸水中煮10min，分裝后儲于-20℃。

（2)工作液

用儲備液按1：100稀釋。

11．20×SSC

NaCl　 175g

檸檬酸三鈉 88g

dH₂O1000ml

固定試劑溶解后，dH₂O定容至1000ml，調(diào)pH至7.4，高壓滅菌。

12．雜交液（高深度，HMmix)

去離子甲酰胺　 6.0ml

100×Denhardt’s液1.0ml

50%硫酸葡聚糖 2.0ml

1%人或鮭精DNA^※

20×SSC

※：臨用前加入，終濃度為100～200μg/ml。

該液為高濃度雜交液， 存于4℃。

13．PBT液

BSA　 5%

TristonX-100/(PBS) 0.1%

注：BSA液用前應(yīng)用Whatman 3mm濾紙過濾。

14．兔抗生物素（α-生物素)單克隆抗體

用PBT液1：100稀釋。

該單抗現(xiàn)可從英國Dako公司購得。

15．金（10～20nm)標(biāo)羊抗兔二抗

用PBT液1：50稀釋。

16．銀溶液（Janesen)

17.Hoedst33258（Sigma)

儲備液（100×)52667788.cn/yishi/

Hoedst染料 5mg

甲醇　 10ml

工作液：用2×SSC 1：100稀釋儲備液。