胃腸道T淋巴細胞分布在上皮層、固有層、粘膜集合和散在淋巴濾泡及腸系膜淋巴結內(nèi)。隨著免疫細胞化學技術廣泛應用和各類T細胞亞群單克隆52667788.cn/yaoshi/抗體的制備成功，為進一步研究不同部位T淋巴細胞的分類和功能起極其重要的作用。
1．上皮內(nèi)T淋巴細胞上皮內(nèi)淋巴細胞（intraepithelial lymphocyte, IEL)是指位于上皮層基底部的T淋巴細胞。近年來，對IEL對鄰近上皮細胞有壓跡，位于兩個上皮細胞交界處，并未進入上皮細胞內(nèi)。近年來，對IEL研究非常深入。已經(jīng)證實75%以上成人小腸IEL是TCRγαβ陽性細胞，說明它們來源于胸腺，接受過抗原刺激。其中大部分為誘導、殺傷性T淋巴細胞（CD8或OKT8陽性)，10%左右為CD7陽性和CD3陰性的IEL，類似NK細胞，有細胞毒作用，但無NK細胞標記，對NK的靶細胞無破壞作用。10%～20%左右為TCRδ陽性IEL，不受胸腺的影響，其中70%CD4和CD8均陰性，為T淋巴細胞前體。說明人的部分IEL通過胸腺外途徑進行分化。內(nèi)毒素等腔內(nèi)抗原與腸上皮細胞微絨毛、腸腺隱窩細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞膜上的組織相關性抗原分子（鼠為MHL-II，人為HLA-DR、HLA-DP和HAL-DR)相結合后，將抗原分子傳遞到CD3陽性T淋巴細胞受體（t lymphocyte receptor, TCR)中的α和β亞單位可變區(qū)進行結合，在CD8分子作用下導致IEL增殖和分泌大量γ-干擾素（γ-INF)，α-腫瘤壞死因子（α-TNF)，和少量的白介素-2（IL-2)，發(fā)揮細胞毒性作用，調(diào)節(jié) 上皮細胞再生和增強對食物抗原的耐受。
2．固有層T淋巴細胞固有層T淋巴細胞（lamina propria lyphocyte, LPL)分散在固有層，約占固有層免疫細胞總數(shù)10%左右。其中CD4陽性細胞（CD4LPL)顯著多于CD8陽性細胞（CD8LPL)。40%CD4LPL表達CD45RO抗原，能產(chǎn)生大量IL-2、IL-4和γ-INF，為記憶性T淋巴細胞，能輔助B細胞轉化成抗體產(chǎn)生細胞并促其分泌抗體。60%CD52667788.cn/jianyan/4LPL表達CD45RA和CD8抗原，能直接抑制抗體產(chǎn)生細胞轉化和分泌。這兩種細胞的比例在調(diào)節(jié) 抗體分泌中起著重要作用。CD8LPL也可以分兩種：一種表達CD28抗原的LPL，能通過ADCC或直接溶解靶細胞。另一種表達CD16抗原，具有自然殺傷功能。LPL能被IL-2激活，激活的LPL能釋放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL，起著自身分泌作用。IL-5能促進抗體產(chǎn)生細胞分泌抗體。
3．胃腸道相關淋巴組織T淋巴細胞胃腸道相關淋巴樣組織（gut – associated lymphoid tissue,GALT)主要包括腸系膜淋巴結和粘膜中集合和散在淋巴濾泡。GALTT淋巴細胞多們于生發(fā)中心的外周部位，約占40%。其中CD8和CD4陽細胞比例與周圍血相似。動物研究證明，腸系膜淋巴結內(nèi)的CD4陽民生細胞多于固有層。分子生物學研究發(fā)現(xiàn)GALTT淋巴細胞含有IL-4和IL-5基因，激活后產(chǎn)生大量IL-4和IL-5，能特異性增加B和T淋巴細胞增殖。抑制B淋巴細胞分化。其表面糖蛋白主要為CD45RA和leu8(CD8)，證明是幼稚T淋巴細胞。它們對抗原刺激的增殖反應低，對刀豆素A等有絲分裂促進劑的增殖反應高，產(chǎn)生IL-2和γ-INF低，輔助作用弱。GALTT淋巴細胞如何調(diào)節(jié) B淋巴細胞轉化成IgA產(chǎn)生細胞和其它免疫細胞的增殖及功能，并不十分清楚。有待進一步研究。
近年研究發(fā)現(xiàn)，除M細胞和巨噬細胞外，胃腸上皮細胞在接受和傳遞抗原中也起重要作用。免疫細胞化學發(fā)現(xiàn)正常小腸上皮細胞微絨毛和側膜有斑片狀MHc II類抗原，人小腸為HLA-DR糖蛋白，能識別、加工和傳遞抗原使粘膜內(nèi)T淋巴細胞產(chǎn)生免疫反應。HLA-DR表達受γ-IFN誘導。因此免疫反應中組織相關性抗原與IEL和LPL淋巴細胞互相進行調(diào)節(jié) 。
1．組織切片中T淋巴細胞80年代以前多用玫瑰花瓣試驗和酸性酯酶方法進行組織切片中T淋巴細胞研究，特異性較差。近年來多用OKT，Leu或CD等系列T淋巴細胞單克隆抗體進行研究，特異性高，可以分類出各種亞群。免疫組化染色中應注意以下幾個方面：
（1)抗體的選擇：根據(jù)不同目的選擇相應的抗體，如要對人胃腸道組織進行研究，可選用OKT系統(tǒng)單抗；對鼠類等進行研究可選用Leu 或Thy系列。如要研究輔助性T淋巴細胞可用OKT4或CD4；研究抑制性T淋巴細胞可用OKT8或CD8等單克隆抗體。
（2)組織加工方法選擇：目前所研究的特異性T淋巴細胞抗原決定簇多位于細胞膜上，用陳舊或普通組織固定和加工方法可能使抗原破壞，應采用新鮮組織和低溫處理。具體方法是：手術或活檢獲得的組織立即用液氮冷凍，或用OCT復合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat冰凍切片后室溫下風干，用4℃純乙醇或丙酮固定10min，PBS沖洗后即可進行免疫細胞化學染色。
（3)染色方法的選擇：因抗原較微量，而且位于細胞膜，應采取敏感性強、特異性高、非特異性著色少的方法。雖然有報道采用間接熒光或間接酶標技術也能顯示特異性T淋巴細胞，我們推薦最好采用PAP或ABC染色技術。具體方法參閱第三，四章 。
2．粘膜分離液中T淋巴細胞一定重量粘膜組織中分離出來的T淋巴細胞也可以用免疫細胞化學進行定量和定性研究。下面介紹用間接免疫熒光技術研究IEL的大致過程：
（1)將手術取得的腸管縱形剪開，將上皮層與固有層分離。
（2)上皮層放在無鎂離子、含100U青霉素和鏈霉素及0.2%疊氮納的PB中清洗，無血液和其它雜質(zhì)后用解剖剪將組織剪碎，用勻漿器磨碎或用超聲粉碎或用膠原酶溶解上皮細胞。
（3)勻漿液通過脫脂棉、尼龍篩（只允許淋巴細胞濾過，除去粘液、碎屑和上皮細胞凝集塊)或金屬網(wǎng)（200目)獲得淋巴細胞懸液。
（4)將硅化玻璃球高壓消毒，沖洗和平衡后將懸浮液過柱，得到的細胞液直接計數(shù)。也可以用淋巴細胞分離液提取，用臺盼藍測定其活性，并加10%FCS-RPMI細胞培養(yǎng)液，淋巴細胞數(shù)應達5×106/ml。
（5)試管內(nèi)加0.1ml細胞液后加OKT系列單抗0.1ml，同時用另一試管加0.1mlPBS作對照�；旌弦涸�4℃放置30～60min（也可以在冰箱過夜)后，PBS（含RPMI)沖洗3次，離心后細胞沉淀物再加PBS至0.1ml。
（6)加0.1mlFITC標記的抗鼠IgG（根據(jù)工作效價)，4℃放置20～30min，PBS洗3次，離心后加在紅細胞計數(shù)板上，熒光顯微鏡觀察。
（7)陽性細胞為細胞膜上有綠色熒光，有的呈顆粒樣，隨細胞滾動。熒光鏡下可計算200個淋巴細胞中陽性細胞所占的百分率，或根據(jù)血細胞計數(shù)板中陽性細胞算出細胞總數(shù)及百分率。
1．IEL在胃腸道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空腸100個上皮細胞有20個IEL，回腸有13個，結腸只有5個，這也可能是惡性腫瘤不發(fā)生在小腸的重要因素之一。我們發(fā)現(xiàn)胃粘膜也有IEL。在胃部炎癥和潰瘍時，上皮及腺體隱窩細胞間的IEL明顯增加。IEL不但參與免疫反應，而且通過偽足與上皮細胞接觸，加速上皮細胞再生。電鏡下胃粘膜也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。IEL與乳糜瀉（coeliac disease, CD)關系最密切。近期研究表明，第12型腺病毒與麥膠蛋白有同源性。CD病人腸道感染這種病毒后，服用麥膠數(shù)小時粘膜中IEL顯著增加。在上皮細胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下與TCR結合，激活TCRαβlEL，發(fā)揮細胞毒作用，導致腸粘膜萎縮，引起脂肪吸收不良和腹瀉等一系列臨床癥狀。增加的TCRγδIEL調(diào)節(jié) TCRαβ的殺傷作用。停服含麥膠食物后，TCRαβIEL明顯減少，上皮細胞再生恢復，臨床癥狀消失。CD病人出現(xiàn)疣狀胃炎也是IEL參與的免疫反應結果。CD病人的腸道淋巴瘤也是來自IEL增殖。器官移植后的宿主排異反應、結腸炎、熱帶性腹瀉、牛奶過敏和某些自身免疫性疾病均有IEL增加。也有人發(fā)現(xiàn)克隆氏病和潰瘍性結腸炎患者結腸IEL細胞毒性作用明顯減弱。當然，IEL增加是繼發(fā)或是原發(fā)，是否IEL是這些疾病的病因，臨床治療和診斷價值如何，還不清楚。而且IEL受年齡、抗原、免疫調(diào)節(jié) 劑（考的松對IEL無影響，環(huán)磷酰胺顯著降低IEL數(shù)量)等因素影響，因此需要深入進行研究。
2．粘膜固有層T淋巴細胞在局部體液免疫中起重要調(diào)節(jié) 作用在GALT中有開關性T淋巴細胞使生發(fā)中心的淋巴母細胞轉化成IgA產(chǎn)生細胞。這些細胞減少或功能缺乏可導致免疫球蛋白A缺乏。有人分離出克隆氏病和潰瘍性結腸炎病人固有層T淋巴細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)輔助性T淋巴細胞減少，抑制性T淋巴細胞顯著增加，可能導致局部免疫失調(diào)，引起細胞毒性或遲發(fā)性過敏反應等，致使炎癥和潰瘍發(fā)生。
3．胃腸道腫瘤細胞中T淋巴細胞研究倍受重視我們及國內(nèi)外一些報道均證明胃癌組織中T淋巴細胞顯著增加，且其細胞毒性大于非癌組織。胃癌病人周圍血T淋巴細胞毒性低于粘膜T淋巴細胞。但有人發(fā)現(xiàn)胃癌組織中T淋巴細胞的ADCC作用較弱。提示粘膜T淋巴細胞可能直接通過細胞毒作用或通過釋放淋巴因子對癌細胞有殺傷作用。近年來有人將癌組織中提取和分離出具有細胞毒作用T淋巴細胞，體外加入IL-2，促其增殖，再注入病人體內(nèi)進行治療，取得明顯療效。
4．上皮細胞的MHC表達也與臨床疾病密切相關有人發(fā)現(xiàn)克隆病、潰瘍性結腸炎、放射性和感染性結腸炎和結節(jié) 病性腸炎患者小腸和結腸HLA-DR明顯增加，而且不成熟的腺體隱窩細胞也有表達。CD急性期和復發(fā)時HLA-DR表達明顯增加，緩解期明顯減少或恢復正常，說明MHC的固有性和變易性所導致的免疫反應的復雜性，在消化道疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要調(diào)節(jié) 作用。
