根據(jù)標(biāo)記物的不同,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù),免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù),免疫鐵蛋白技術(shù),免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù),親和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),免疫電子顯微鏡技術(shù)等。近些年來(lái),核酸分子原位雜交技術(shù)采用生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針,和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)密切結(jié)合,發(fā)展為雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。不同的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),各具有獨(dú)特的試劑和方法,但其基本技術(shù)方法是相似的,都包括抗休的制備,組織材料的處理、免疫染色、對(duì)照試驗(yàn)、顯微鏡觀察等步驟。還有雙重和多重標(biāo)記技術(shù)也有重要的用途。
(一)抗體的制備
這是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的首要試劑,必需制備具有很高特異性和敏感性的高效價(jià)抗體,這將在本書(shū)第二章 中詳述。目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)各種特異性抗體日益增多,許多實(shí)驗(yàn)室直接應(yīng)用市售產(chǎn)品,現(xiàn)在我國(guó)自制抗體種類(lèi)少,發(fā)展抗體生產(chǎn)十分必要。尤其要定位一種新的抗原物質(zhì),能夠自制較好。
(二)抗體的配制
包括抗體貯存液和抗體使用液的配制方法。新制備或購(gòu)進(jìn)的是原液或凍干品,抗血清為全血清,單克隆抗體是培養(yǎng)上清液或腹水。
1.抗體貯存獲得新抗體后,應(yīng)先根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的抗體效價(jià),將其分裝,可每10μl或100μl/支分裝入安瓿或0.25ml帶蓋塑料管中,密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存?zhèn)溆,一般可保?~2年。小量分裝的抗體可1次用完,避免反復(fù)凍融而影響效價(jià)的降低。一般用前新鮮配制使用液體,稀釋的抗體不能長(zhǎng)時(shí)間保存,在4。C可存入1~3天,超過(guò)7天效價(jià)顯著降低。
2.抗體使用液的配制這是任何免疫細(xì)胞化學(xué)方法中最重要的一環(huán),無(wú)論是一抗、二抗和各種標(biāo)記抗體,用前都必須按不同免疫染色方法和抗原性強(qiáng)弱與抗原的多少,稀釋使用的各種抗體原液,以便獲得最佳免疫染色結(jié)果。
(1)抗體最佳稀釋度的測(cè)定方法:用已知陽(yáng)性抗原切片,進(jìn)行免疫染色,將其陽(yáng)性強(qiáng)度與背景染色強(qiáng)度以“+”表示,可分為++++、+++、++、+、(-)。++++為最強(qiáng)陽(yáng)性,+++為強(qiáng)陽(yáng)性,++為較強(qiáng)陽(yáng)性,+為弱陽(yáng)性,(-)為陰性。
①直接測(cè)定法:用于測(cè)定第一抗體的最佳稀釋度,其它條件穩(wěn)定可靠。將一抗稀釋為1:50、1:100、1:2001:400、1:500等5個(gè)稀釋度滴加在陽(yáng)性抗原切片上,同時(shí)設(shè)一替代和陰性對(duì)照,結(jié)果如表1-1:
表 1-1 選擇最佳稀釋抗血清方法
一抗稀釋度 | 特異性染色強(qiáng)度 | 非特異性背景染色度 |
1:50 | ++++ | ++ |
1:100 | ++++ | ++ |
1:200 | ++++ | ++ |
1:400 | +++ | + |
1:500 | ++ | (-) |
陰性對(duì)照 | (-) | (-) |
從表中結(jié)果可見(jiàn),第一抗體稀釋到1:400時(shí)陽(yáng)性結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性,背景染色減少,其最佳稀釋度在1:400~500之間。再作1:420、1:440、1:460、1:480、1:500稀釋后染色,找出最佳稀釋度。
②棋盤(pán)(方陣)測(cè)定方法:當(dāng)測(cè)定兩種以上抗體的最佳配合稀釋度時(shí),必須采用此法(見(jiàn)表1-2)。
表1-2 兩種以上抗體最佳配合稀釋度選擇表
第二抗體 | 第 一 抗 體 | |||
1:500 | 1:1000 | 1:2000 | 1:4000 | |
1:100 | ++++(++) | ++++(+) | +++(±) | +(-) |
1:200 | ++++(+) | +++(-) | ++(-) | ++(-) |
1:400 | ++(-) | +(-) | - | - |
括號(hào)內(nèi)為背景染色結(jié)果
從表中可見(jiàn)第一抗體1:1000,第二抗體1:2000接近最佳稀釋度,再將一 抗體作1:600、1:700、1:800、1:900和1:1000稀釋?zhuān)纯烧页鲎罴严♂尪取?/p>
(2)抗體稀釋液的配制:常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS緩沖液作抗體稀釋液。可用以下方法配制專(zhuān)用的抗體稀釋液,防止抗體效價(jià)下降,減少抗體在組織上的非特異性吸附:取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml,加溫到60。C,再加入優(yōu)質(zhì)明膠100mg,攪拌溶解后,冷卻至室溫,加入1g牛血清白蛋白,加入NaN3200mg溶解后,過(guò)濾,分裝,4。C保存。
抗體的最佳稀釋度由于各種抗體的效價(jià)不同,組織中抗原強(qiáng)弱不一,應(yīng)根據(jù)不同情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整,以取得中等陽(yáng)性稀釋度為佳,因其既適合于抗原性強(qiáng)和含量多的標(biāo)本,也可用于抗原性弱的標(biāo)本。
組織材料的處理是獲得良好免疫組織化學(xué)結(jié)果的前提,必需保證要檢測(cè)的細(xì)胞或組織取材新鮮,固定及時(shí),形態(tài)保存完好,抗原物質(zhì)的抗原性不丟失、不擴(kuò)散和被破壞(下節(jié) 詳述)。
可在細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行免疫染色。一般程序是:①標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)結(jié)合;②用PBS洗去未結(jié)合的成分;③直接觀察結(jié)果(免疫熒光直接法);或顯色后再用顯微鏡觀察(免疫酶直接法)。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出間接法,多層法,雙標(biāo)記法等各種方法,將在本書(shū)各有關(guān)章 節(jié) 內(nèi)詳述。
在免疫染色中應(yīng)特別注意增強(qiáng)特異性染色,減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都必須注意以下幾個(gè)問(wèn)題:
1.增強(qiáng)特異性染色的方法
(1)蛋白酶消化法:其作用是暴露抗原,增加細(xì)胞和組織的通透性,以便抗體與抗原最大限度的結(jié)合,增強(qiáng)特異性染色和避免非特異性染色。這種方法已廣泛用于各種免疫細(xì)胞化學(xué)染色,常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及鏈霉蛋白酶(pronase)等;也可用3mol/L尿素處理切片,達(dá)到酶消化的目的。各種酶的配制和使用方法詳見(jiàn)附錄。酶消化的時(shí)間和溫度因各種抗原對(duì)消化的敏感性不同,應(yīng)根據(jù)酶的活性通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定,消化的時(shí)間還與組織固定的時(shí)間有關(guān),一般是陳舊固定組織所需時(shí)間長(zhǎng),以37。C為宜。消化時(shí)間短的組織可在室溫中進(jìn)行。消化處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)能損傷組織,易使切片脫落,應(yīng)使用切片粘附劑,消化時(shí)間盡量縮短。
(2)合適的抗體稀釋52667788.cn/wszg/度:抗體的濃度是免疫染色的關(guān)鍵,如果抗體濃度過(guò)高,抗體分子過(guò)多于抗原決定簇,可導(dǎo)致抗體結(jié)合減少,產(chǎn)生陰性結(jié)果。此陰性結(jié)果并不一定缺少抗原,而是由于抗體過(guò)量。這種現(xiàn)象類(lèi)似于凝集反應(yīng)中的前帶效應(yīng)(Prozone effect )。因此,必須使用一系列稀釋作“棋盤(pán)式效價(jià)滴定”檢測(cè)抗體的合適稀釋度,以得到最大強(qiáng)度的特異性染色和最弱的背景染色?贵w稀釋度應(yīng)根據(jù):①抗體效價(jià)高,溶液中特異性抗體濃度越高,工作稀釋度越高;②一般講,應(yīng)用的抗體稀釋度越大,溫育時(shí)間越長(zhǎng)。③抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時(shí)才能防止非特異性背景染色;④稀釋用緩沖液的種類(lèi)、標(biāo)本的固定和處理過(guò)程等也可影響稀釋度。所以合適的稀釋度應(yīng)根據(jù)自己的情況測(cè)定?贵w的稀釋主要是指第一抗體,因?yàn)榈谝豢贵w中特異性抗體合適的嘗試是關(guān)鍵,應(yīng)用高稀釋度第一抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應(yīng),減少或消除其中交叉抗體反應(yīng)。
(3)溫育時(shí)間:大部分抗體溫育時(shí)間為30-60min,必要時(shí)可4。C過(guò)夜(約18h)。溫育的溫度常用37。C,也可在室溫中進(jìn)行,對(duì)抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)的以室溫為佳。37。C可增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng);適用于多數(shù)抗體染色,但應(yīng)注意在濕盒中進(jìn)行,防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。
(4)多層染色法:對(duì)弱的抗原可用間接法(雙層)、PAP和ABC法(三層)、四或五層PAP法或ABC法,或PAP和ABC聯(lián)合染色法等,可以很大程度的提高敏感性,獲得良好結(jié)果。
(5)顯色增敏劑的應(yīng)用,如在過(guò)氧化物酶底物中加入氯化鎳,可提高顯色敏感度4倍。
2.減少或消除非特異性染色的方法 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽(yáng)性染色稱(chēng)為非特異性背景染色,最常見(jiàn)的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加制備第二抗體動(dòng)物之非免疫血清(1:5-1:20)封閉組織上帶電荷基團(tuán)而除去與第一抗體非特異性結(jié)合。必要時(shí)可加入2%-5%牛血清白蛋白,可進(jìn)一步減少非特異性染色。作用時(shí)間為10-20min。也可用除制備第一抗體以外的其它動(dòng)物血清(非免疫的)。有明顯溶血的血清不能用,以免產(chǎn)生非特異性染色。免疫熒光染色時(shí),可用0.01%伊文氏蘭(PBS溶液)稀釋熒光抗體,對(duì)消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。當(dāng)然使用特異性高、效價(jià)高的第一抗體是最重要的條件。洗滌用的緩沖液中加入0.85%~1%NaCl成為高鹽溶液,充分洗滌切片,能有效的減少非特異性結(jié)合而減少背景染色。
3.顯色反應(yīng)的控制 免疫酶染色應(yīng)注意控制:①成色質(zhì)濃度和溫育時(shí)間可調(diào)節(jié) ,增加成色質(zhì)的量和/或增加底物溫育時(shí)間,可增加反應(yīng)產(chǎn)物強(qiáng)度。著色太深可減少溫育反應(yīng)時(shí)間。②過(guò)氧化物酶顯色時(shí),H2O2較大濃度將使顯色反應(yīng)過(guò)快而致背景加深;過(guò)量H2O2可能抑制酶的活性。
4.復(fù)染 根據(jù)所用的染色方法和呈顯顏色等,可選用適當(dāng)?shù)膹?fù)染方法。如陽(yáng)性結(jié)果呈紅或棕色,則用蘇木素將細(xì)胞核染成蘭色,以便定位檢測(cè)。也可用1%~2%甲基綠復(fù)染。
其目的在于證明和肯定陽(yáng)性結(jié)果的特異性,排除非特異性疑問(wèn)。主要是針對(duì)第一抗體對(duì)照,常用的對(duì)照方法包括:①陽(yáng)性對(duì)照;②陰性對(duì)照;③阻斷試驗(yàn);④替代對(duì)照;⑤空白對(duì)照;⑥自身對(duì)照;⑦吸收試驗(yàn)。
(一)陽(yáng)性對(duì)照
用已知抗原陽(yáng)性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,對(duì)照52667788.cn/shouyi/切片應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果,稱(chēng)為陽(yáng)性對(duì)照。證明全過(guò)程均符合要求,尤其當(dāng)待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時(shí),陽(yáng)性對(duì)照尤為重要。
(二)陰性對(duì)照
用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照,應(yīng)呈陰性結(jié)果,稱(chēng)陰性對(duì)照,是陰性對(duì)照的一種。其實(shí)空白、替代、吸收和抑制試驗(yàn)都屬陰性對(duì)照。當(dāng)待檢標(biāo)本呈陽(yáng)性結(jié)果時(shí),陰性對(duì)照就更加重要,用以排除假陽(yáng)性。對(duì)照的具體方法步驟,在有關(guān)章 節(jié) 詳述。
對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的判斷應(yīng)持科學(xué)的慎重態(tài)度,要準(zhǔn)確判斷陽(yáng)性和陰性,排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果,必須嚴(yán)格對(duì)照實(shí)驗(yàn),對(duì)新發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性結(jié)果,除有對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果之外,應(yīng)進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),要求用幾種方法進(jìn)行驗(yàn)證,如用PAP法陽(yáng)性,可再用ABC法驗(yàn)證。必須學(xué)會(huì)判斷特異性染色和非特異性染色,對(duì)初學(xué)者更為重要,否則會(huì)得出不科學(xué)的結(jié)論。特異性染色與非特異性染色的鑒別點(diǎn)主要在于特異性反應(yīng)產(chǎn)物常分布于特定的部位,如胞漿內(nèi),也有分布在細(xì)胞核和細(xì)胞表面的,即具有結(jié)構(gòu)性。特異性染色表現(xiàn)為在同一切片上呈現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性染色結(jié)果。非特異性染色表現(xiàn)為無(wú)一定的分布規(guī)律,常為某一部位成片的均勻著色,細(xì)胞和周?chē)慕Y(jié)締組織均無(wú)區(qū)別的著色,或結(jié)締組織呈現(xiàn)很強(qiáng)的染色。非特異性染色常出現(xiàn)在干燥切片的邊緣,有刀痕或組織折疊的部位。在過(guò)大的組織塊,中心固定不良也會(huì)導(dǎo)致非特異性染色。有時(shí)可見(jiàn)非特異性染色和特異性染色同時(shí)存在,由于過(guò)強(qiáng)的非特異性染色背景不但影響對(duì)特異性染色結(jié)果的觀察和記錄,而且令人對(duì)其特異性結(jié)果產(chǎn)生懷疑。
(一)陽(yáng)性細(xì)胞的染色特征
免疫細(xì)胞化學(xué)的呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量,可作為定性、定位和定量的依據(jù)。
(1)陽(yáng)性細(xì)胞染色分布有三種類(lèi)型:①胞漿;②細(xì)胞核;③細(xì)胞膜表面。大部分抗原見(jiàn)于細(xì)胞漿,可見(jiàn)于整個(gè)胞漿或部分胞漿。
(2)陽(yáng)性細(xì)胞分布可分為煙性和彌漫性。
(3)由于細(xì)胞內(nèi)含抗原量的不同,所以染色強(qiáng)度不一。如果細(xì)胞之間染色強(qiáng)度相同,常提示其反應(yīng)為非特異性。
(4)陽(yáng)性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞,且與陰性細(xì)胞相互交雜分布;而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞,而是累及一片細(xì)胞。
(5)切片邊緣、刀痕或皺折區(qū)域,壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū),膠原結(jié)締組織等,常表現(xiàn)為相同的陽(yáng)性染色強(qiáng)度,不能用于判斷陽(yáng)性。
(二)染色失敗的幾種原因
(1)所染的全部切片均為陰性結(jié)果:包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi),全部呈陰性反應(yīng),原因可能是:①染色未嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行;②漏加一種抗體,或抗體失效;③緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉,抑制了酶的活性;④底物中所加H2O2量少或失效;⑤復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)。
(2)所有切片均呈弱陽(yáng)性反應(yīng):①切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃,或干燥了;②緩沖液配制中未加氯化鈉和pH值不準(zhǔn)確,洗滌不徹底;③使用已變色的呈色底物溶液,或呈色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng);④抗體溫育的時(shí)間過(guò)長(zhǎng);⑤H2O2濃度過(guò)高,呈色速度過(guò)快;⑥粘附劑太厚。
(3)所有切片背景過(guò)深;①未用酶消化處理切片;②切片或涂片過(guò)厚;③漂洗不夠;④底物呈色反應(yīng)過(guò)久;⑤蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血;⑥使用全血清抗體稀釋不夠。
(4)陽(yáng)性對(duì)照染色良好,檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反應(yīng),固定和處理不當(dāng)是最常見(jiàn)的原因。
對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的定量判斷常規(guī)方法是根據(jù)呈色深淺和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分類(lèi)計(jì)數(shù),以(-)、+、++、+++等分級(jí)和計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。現(xiàn)在已采用圖象分析計(jì)量,本書(shū)第九章 將詳細(xì)敘述這種使免疫細(xì)胞化學(xué)的定量成為可能的先進(jìn)的形態(tài)定量方法。另外,第十章 將詳細(xì)途述另一種先進(jìn)的免疫細(xì)胞化學(xué)計(jì)量分類(lèi)術(shù)-流式細(xì)胞光度計(jì)技術(shù)。