細胞和分子免疫學:第二節(jié)　免疫球蛋白基因的結(jié)構(gòu)和多樣性

表3-2　免疫球蛋白基因定位

免疫球蛋白（Ig)的分子由IGK、IGL和IGH基因編碼。IGK、IGL和IGH基因定位于不同的染色體（表3-2)。編碼一條Ig多肽鏈的基因是由胚系中數(shù)個分隔開的DNA片段（基因片段)經(jīng)重排而形成。1965年Dreyer和Bennet首先提出假說，認為Ig的V區(qū)和C區(qū)由分隔存在的基因所編碼，在淋巴細胞發(fā)育過程中這兩個基因發(fā)生易位而重排在一起。1976年Hozumi和Tonegawa應(yīng)用DNA重組技術(shù)證實了這一假說。

一、　Ig重鏈基因的結(jié)構(gòu)和重排

Ig重鏈基因是由V、D、J和C四種不同基因片段所組成。

（一)Ig重鏈可變區(qū)（V區(qū))基因

重鏈可變區(qū)基因是由V、D、J三種基因片段經(jīng)重排后所形成。

1.重鏈V區(qū)基因的組成　編碼重鏈V區(qū)基因長約1000～2000kb，包括V、D、J三組基因片段。

（1)重鏈V基因片段：小鼠V_H基因片段數(shù)目為250～10052667788.cn/yishi/0個。根據(jù)V_H基因片段核酸序列的相似性（>80%同源性)，至少可分為11個家族（family).人V基因片段約為100個，至少可分為6個家族，每個家族含有2～60個成員不等。V基因片段由2個編碼區(qū)（codingregions)組成：第一個編碼區(qū)編碼大部分信號序列；第二個編碼區(qū)編碼信號序列羧基端側(cè)的4個氨基酸殘基和可變區(qū)約98個氨基酸殘基，包括互補決定區(qū)1和2（complementarity determining region 1和2，CDR1和CDR2)。

（2)重鏈D基因片段：D（diversity)是指多樣性。D_H基因片段僅存在于重鏈基因中而不存在于輕鏈基因。D基因片段編碼重鏈V區(qū)大部分CDR3。小鼠D_H共有12個片段，位于V_H和J_H基因片段之間，大部分D_H片段較為集中，約占60～80kb，但靠上游的D_H可能位于V_H區(qū)域內(nèi)，最后一個D_H片段與J_H基因5"端相距約0.7kb。人類D_H片段可能有10～20個左右。

（3)重鏈的J基因片段：J（joining)指連接，是連接V和C基因片段。J_H編碼約15～17個氨基酸殘基，包括重鏈V區(qū)CDR3除D_H編碼外的其余部分和第4骨架區(qū)。小鼠J_H基因片段有4個，與Cμ相距約6.5kb。人有9個J_H，其中6個是有功能的J_H基因片段。

V、D、J基因片段經(jīng)重組連接在一起，組成2個外顯子，一個外顯子編碼信號序列的大部分，另一個外顯子編碼信號序列的其余部分和重鏈可變區(qū)。

小鼠和人在胚系中Ig基因的結(jié)構(gòu)見圖3-4和圖3-5。

2.重鏈可變區(qū)基因的移位　在重鏈基因重排開始時，二條染色體上都發(fā)生D基因片段移位到J基因片段而發(fā)生D-J基因連接。在此以后，只有其中一條染色體上的V基因片段與D-J基因片段連接。V_H基因片段5"端含有啟動子（promoter)，J_H和C_μ基因片段之間的內(nèi)含子中含有轉(zhuǎn)錄增強子（transcriptinalenhancer)。如果一條染色體V_H基因與D-J基因重排無效（non-productive)，另一條染色體的V_H基因片段開始發(fā)生移位，與D-J基因片段連接。

某些與Ig基因片段重排有關(guān)的特殊序列稱為識別序列（recognition sequences)，位于V基因片段的3"端與J基因片段的5"端之間以及D基因片段的兩側(cè)。V基因片段3"端、J基因片段5"端以及D基因片段的兩側(cè)也是DNA重排識別信號所在區(qū)域，這些識別信號包括三部分：（1)高度保守的回文結(jié)構(gòu)的七聚體（palindromic heptamer);(2)較少保守、富含A/T的九聚體(nonamer);（3)七聚體和九聚體之間不保守的間隔序列（spacer sequence)，含有12±1堿基對或23±1堿基對。根據(jù)12/23堿基對間隔規(guī)則（或稱1圈/2圈定律)，兩個基因片段的重組僅發(fā)生在兩個基因片段之間：各有一個12個堿基對片段和一個23個堿基對片段的結(jié)構(gòu)（圖3-6)。

圖3-4 小鼠Ig基因結(jié)構(gòu)

注：（1)L：先導序列基因片段　V：可變區(qū)基因片段　D：D基因片段
J：J基因片段　C：恒定區(qū)基因片段　E：轉(zhuǎn)錄增強子
S：轉(zhuǎn)換區(qū)　*：假基因
（2)內(nèi)含子區(qū)域所標數(shù)字表示DNA長度（kb)。
（3)每個C_H基因用一個方框表示，實際上包括幾個外顯子，如C_μ含有6個外顯子。
（4)λ基因增強子位于Cλ4和Cλ1基因片段的下游。

圖3-5 人Ig基因結(jié)構(gòu)

注：（1)L：先導序列基因片段　V：可變區(qū)基因片段　D：D基因片段
J：J基因片段　C：恒定區(qū)基因片　*：假基因
（2)內(nèi)含子區(qū)域所標數(shù)字表示DNA長度（kb)
（3)每個C_H基因用一個方框表示，實際上包括幾個外顯子

參與V/（D)/J基因重組過程的酶稱為V/（D)/J重組酶（recombinase),有關(guān)于執(zhí)行識別、切割和重新連接基因片段重組酶的純化和鑒定工作還剛開始。重組酶實際上包括重組過程中多種酶的活性。最近在前B細胞（pre-b cell)中已經(jīng)鑒定出兩種刺激Ig基因重排的基因，稱為重組激活基因1（recombinationactivating gene 1,RAG-1)和重組激活基因2（RAG-2)，其確切的作用機理還不太清楚。重組酶作用的特點是：（1)淋巴細胞特異性的，非淋巴樣細胞如成纖維細胞無重組酶活性，這可能解釋了Ig基因的重排僅見于B淋巴細胞。目前一般認為T細胞TCR基因重排中的重組酶與B細胞中重組酶相同或相似。（2)重組酶發(fā)揮其功能僅限于B細胞發(fā)育早期，未成熟B細胞如前B細胞（pre-b cell)細胞系重組酶活性很高，但抗體生成細胞或骨髓瘤細胞無明顯重組酶活性，因此時B細胞已經(jīng)分泌某一特異性抗體，不再發(fā)生重排其它的Ig基因，因此也不會改變原先所產(chǎn)生抗體的特異性。轉(zhuǎn)換重組酶（switch recom-binase)可能與VDJ重組酶（VDJ recombinase)相似，但缺乏七聚體/九聚體（heptamer/nonamer)識別蛋白。重組酶功能異�？蓪е聶C體不能產(chǎn)生Ig和TCR，很可能與重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combinedimmunodeficiency,SCID)的發(fā)生有關(guān)。例如SCID小鼠16號染色體著絲點末端存在一個scid基因，為單基因常染色體遺傳基因。scid基因純合將影響DNA重組酶的識別功能，在TCR或BCR基因片段重排時不能識別正確的位點，使T細胞、B細胞在淋巴干細胞發(fā)育早期即夭折，導致重癥聯(lián)合免疫缺陷。

圖3-6　參與Ig基因重排組酶識別的DNA序列

（二)Ig重鏈恒定區(qū)（C區(qū))基因

1.重鏈C基因片段　重鏈恒定區(qū)基因由多個外顯子組成，位于J基因片段的下游，至少相隔1.3kb。每1個外顯子編碼1個結(jié)構(gòu)域（domain)，鉸鏈區(qū)（hinge region)是由單獨的外顯子所編碼，但α重鏈的鉸鏈區(qū)是由C_H2外顯子的5"端所編碼。大多分泌的Ig重鏈羧基端片段或稱尾端“tail piece”是由最后一個C_H外顯子的3"端所編碼，而δ鏈的“tailpiece”是由一個單獨的外顯子所編碼。小鼠C_H基因約占2000kb，其外顯子從5"端到3"排列的順序是Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cγ2b-Cγ2a-Cε-Cα。人C_H基因外顯子排列的順序是Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cε2（pseudo基因)Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε1-Cα2。其中基因片段Cγ3-Cγ1-Cε2-Cα1和基因片段Cγ2-Cγ4-Cε1-Cα2可能是一個片段經(jīng)過一次復制而得，為研究C_H基因的起源和進化提供有用的依據(jù)。

2.免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換　1964年Nossal等發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞存在著類型的轉(zhuǎn)換。Ig類型轉(zhuǎn)換（class switch)或稱同種型轉(zhuǎn)換（isotype switch)是指一個B淋巴細胞克隆在分化過程中V_H基因片段保持不變，而發(fā)生C_H基因節(jié)段的重排、比較C_H基因片段重排后基因編碼的產(chǎn)物，V區(qū)相同而C區(qū)不同，即識別抗原特異性不變，而類或亞類發(fā)生改變。這種類型轉(zhuǎn)換在無明顯誘因下可自發(fā)產(chǎn)生。

局部微環(huán)境和細胞因子可影響和調(diào)節(jié)免疫球蛋白類型的轉(zhuǎn)換，如在腸道派伊爾氏結(jié)的B細胞V基因片段優(yōu)先轉(zhuǎn)換到Cα1進行重排，因此主要合成和分泌IgA。在體外向經(jīng)LPS刺激的小鼠B細胞中加入IL-4，可促進B細胞產(chǎn)生IgG1和IgE，抑制IgG2b產(chǎn)生；低濃度的IL-4主要誘導產(chǎn)生IgG1，高濃度IL-4主要誘導產(chǎn)生IgE。面IFN-γ則誘導小鼠B細胞合成IgG2a，抑制IgE的產(chǎn)生。TGF-β、IL-5和IL-6對IgA的產(chǎn)生具有促進作用（表3-3)。細胞因子調(diào)節(jié)B細胞Ig類別轉(zhuǎn)換的機理可能是：（1)刺激某些細胞的克隆選擇性的增殖，使分泌某特定類、亞類抗體的克隆細胞增加，如IL-5、IL-6促進IgA。產(chǎn)生除通過同種型轉(zhuǎn)換進行調(diào)節(jié)外，還可選擇性促進IgA定向細胞分化增殖為IgA分泌細胞。（2)通過誘導特定位置上兩個轉(zhuǎn)換區(qū)的重組，誘導B細胞由分泌IgM向某一同種型Ig轉(zhuǎn)換。如高濃度IL-4促進LPS誘導小鼠B細胞產(chǎn)生IgE，主要是使Cε轉(zhuǎn)換區(qū)與重組酶的接近（accessibility),通過同種型轉(zhuǎn)換促進IgE的產(chǎn)生。

表3-3　細胞因子對LPS誘導的Ig類和
亞類轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用（占總Ig%)

注：（1)純化的小鼠IgM+IgD+B細胞體外培養(yǎng)時，加入不同的細胞因子和LPS，然后檢　LPS，然后檢測不同類或亞類免疫球蛋白的百分比。
（2)由于未檢測所有類和亞類Ig，所以每組Ig總百分比不到或接近100%。

Ig類型轉(zhuǎn)換可能通過以下兩種機理。

（1)缺失模型（deletion model):又稱linear orderly deletiom ofH chain genes。以小鼠C_H基因為例，如Cμ和Cδ基因片段被缺失，那么先前重排的VDJ就會按照順序與下一個C_H基因即Cγ3發(fā)生重排，經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后，編碼γ3重鏈；如缺失所有的γ鏈亞類基因，依次會產(chǎn)生ε鏈。上述模型在被刺激后小鼠B細胞在體外培養(yǎng)中產(chǎn)生Ig類別的順序得到證實，即先產(chǎn)生IgM，然后依次產(chǎn)生IgG3和IgG1等。但這個模型不能解釋免疫動物或抗原刺激B細胞培養(yǎng)中單個B細胞可同時表達幾種不同類或亞類的重鏈。

（2)RNA的不同剪接：除DNA水平的Ig類型轉(zhuǎn)換形成外，RNA水平的不同剪接（alternative RNA splicing)也可產(chǎn)生不同的Ig類型。 Cμ和Cδ基因片段之間無S區(qū)，IgM和IgD共表達的B細胞系DNA分析表明，Cμ和Cδ基因片段沒有發(fā)生重排，相同的V_H出現(xiàn)在μ或δ鏈的mRNA上，表明它們可能有一個共同的mRNA前體，通過不同的或差異剪接（differential splicing)分別形成μ鏈和δ鏈mRNA。初級RNA轉(zhuǎn)錄本（primary RNa transcript)是由VDJ復合體連接Cμ和Cδ基因片段經(jīng)轉(zhuǎn)錄后形成。如果在剪接過程中切除初級RNA轉(zhuǎn)錄本中的Cδ部分，經(jīng)加工后形成μmRNA；如去除初級RNA轉(zhuǎn)錄本中的Cμ部分，則加工后形成δmRNA。這兩種mRNA分別被翻譯，使單個B細胞同時產(chǎn)生μ和δ鏈，同時表達IgM和IgD。同樣的機理可從一條長的primary RNA轉(zhuǎn)錄本中加工為 μmRNA和εmRNA（或其它重鏈mRNA)，同時表達IgM、IgE或其它類Ig。

圖3-7　Ig類型轉(zhuǎn)換缺失模型

（三)膜表面Ig重鏈基因

膜表面Ig（mIg)重鏈基因的外顯子結(jié)構(gòu)與分泌性Ig重鏈的基因外顯子結(jié)構(gòu)基本相同，但在基因組的3"端有所不同。作為識別抗原受體的mIg，其重鏈羧基端有一段疏水性氨基酸插入到胞膜雙層脂質(zhì)中，mIg重鏈的轉(zhuǎn)錄本要比分泌性重鏈轉(zhuǎn)錄本多1～2個外顯子，與分泌性重鏈基因最后一個外顯子至少相隔1.4kb,這1～2個外顯子編碼重鏈的羧基端部分，這部分氨基酸殘基的數(shù)目視重鏈不同而有所差異，如鼠或人mIgμ鏈的這一部分約為41個氨基酸殘基，而鼠mIgε鏈這部分卻有72個氨基酸殘基。這個區(qū)域可分為三個部分：（1)一個酸性間隔子，靠氨基端側(cè)，與最后一個C_H結(jié)構(gòu)域相連，位于細胞膜外側(cè)；（2)跨膜部分，由26個不帶電荷的疏水氨基酸形成一個α螺旋，穿過胞膜的脂質(zhì)雙層；（3)胞漿內(nèi)羧基端部分，3～28個氨基酸殘基不等，可能與信號傳遞有關(guān)。

圖3-8　RNA的差異拼接與IgM和IgD共同表達在一個B細胞上

分泌形式的μ、α和δ重鏈最后一個結(jié)構(gòu)域后有一段額外延長的由帶電荷氨基酸組成的序列，稱為尾片（tail pieces)，約含20個氨基酸，在IgM和IgA分子中，單體Ig尾片通過二硫鍵相互連接或與J鏈形成二聚體或多聚體。分泌形式μ鏈的mRNA含有V、D、J、C_μ1、C_μ2、C_μ3、C_μ4和C_μ43"端一個小的外顯子轉(zhuǎn)錄區(qū)。

Ig重鏈基因除L、V、D、J和C基因片段外，在內(nèi)含子中還有一些與mRNA轉(zhuǎn)錄和免疫球蛋白類的轉(zhuǎn)換有關(guān)的結(jié)構(gòu)。

（1)插入順序（intervening sepuence,IS)：有IS1、IS2、IS3……等。

（2)轉(zhuǎn)換區(qū)序列：即S區(qū)（switch region)。除Cδ外，各個恒定區(qū)基因片段上游都有一個同源重復序列的S區(qū)，約占2～10kb，分別命名為Sμ、Sγ、Sα和Sε等，與Ig類和亞類的轉(zhuǎn)換有關(guān)。S區(qū)含有眾多串聯(lián)的高度保守的DNA重復序列，每個重復序列可長到52bp，其確切的功能還不清楚。如Sμ的結(jié)構(gòu)為[（GAGCT)nGGGGT]m，n一般為2～5，但有時可達17，m可達150。目前關(guān)于H鏈轉(zhuǎn)換區(qū)的研究主要以小鼠為模型，如4個Sγ是由49bp長的基序的重復序列所組成。Sα至少由長為80pb的15個重復序列，Sε的重復序列長為60bp。在小鼠，B淋巴細胞經(jīng)T細胞非依賴性活化后常發(fā)生Sμ/Sγ3和Sμ/Sγ2b的重組，因此在無T細胞存在條件下，LPS活化小鼠B細胞成為淋巴母細胞，主要轉(zhuǎn)換Ig的亞類為IgG3和IgG2b。

（3)啟動子：靠近每個V基因轉(zhuǎn)錄位點的上游，含有TATA盒，控制RNA多聚酶Ⅱ作用下的轉(zhuǎn)錄過程。大多數(shù)Ig的啟動子含有許多DNA序列，包括一個保守的8個核苷酸序列，可能是核DNA結(jié)合蛋白（nuclear DNA-binding proteins)結(jié)合部位，在轉(zhuǎn)錄過程中起著重要作用。由于核DNA結(jié)合蛋白是由其它基因所編碼，因此這種作52667788.cn用方式被稱為反式作用（transacting).

圖3-9　膜表面和分泌的Igμ基因及μ鏈羧基端結(jié)構(gòu)的比較

注：（a)初級RNA轉(zhuǎn)錄本通過不同的剪接加工，分別形成分泌型μmRNA和膜型μmRNA。
（b)蘇氨酸（T)為Cμ4第556位氨基酸。膜表面μ重鏈的556氨基酸后還有41個氨基酸，其中富含帶負電氨基酸胞膜外區(qū)12個氨基酸，26個疏水性氨基酸組成的穿膜區(qū)以及胞漿區(qū)3個氨基酸；分泌型μ重鏈在556位氨基酸后有20個氨基酸組成的尾片，C末端倒數(shù)第二個為半胱氨酸。

（4)增強子（E)：在人和小鼠和重鏈和κ輕鏈中發(fā)現(xiàn)有增強子，其核苷酸序列為TGGTAAG。在H鏈基因中，增強子位于J_H3"端側(cè)。當H鏈VDJ或κ鏈VJ重排后，V基因上游的啟動子靠近增強子，使V（D)JC基因重排后開始更為有效的轉(zhuǎn)錄。增強子作用方式與啟動子不同，呈方向非依賴方式（orientation-independent manner),即增強子可作用于被轉(zhuǎn)錄基因的上游或下游。此外，增強子的作用是細胞特異性。

已重排Ig基因的轉(zhuǎn)錄起始于TATA盒下游約20核苷酸處，轉(zhuǎn)錄至C基因后，產(chǎn)生初級RNA（primary RNA)轉(zhuǎn)錄本，在3"端切斷后進行多聚腺苷酸化（polyadenylation),剪接掉不編碼的內(nèi)容含子，如J區(qū)與C區(qū)之間的不編碼序列是在RNA水平上被剪接掉。

圖3-10 小鼠μ鏈的基因重排順序、轉(zhuǎn)錄和合成

（四)重鏈基因重排、轉(zhuǎn)錄和多肽鏈的合成。

以μ鏈基因的重排順序、轉(zhuǎn)錄和μ鏈合成為例，見圖3-10。

二、Ig輕鏈基因的結(jié)構(gòu)和重排

在Ig重鏈基因重排后，輕鏈的可變區(qū)基因片段隨之發(fā)生重排，V與J基因片段并列在一起。κ輕鏈基因先發(fā)生重排，如果κ基因重排無效，隨即發(fā)生λ基因的重排。

（一)κ鏈基因的結(jié)構(gòu)和重排

在小鼠，Vκ基因片段約有250個，間隔距離平均為10～12kb；Jκ有5個，其中4個有功能：Cκ只有1個。在人類，Vκ基因片段約有85～100個，編碼V區(qū)氨基端的1～95位氨基酸，包括CDR1、CDR2和部分CDR3。根據(jù)DNA相似性程度，Vκ可分為16個組。在胚系DNA水平上，Vκ基因片段分散約占2000kb之長，占人2號染色體長度的百分之一左右。Jκ基因片段有5個，編碼第96～108氨基酸。Jκ與最后一個Vκ基因片段的3′端相距為23kb，但與Cκ外顯子靠得較近。Cκ也只有1個，編碼C區(qū)（109～214氨基酸)，所有κ輕鏈具有同一結(jié)構(gòu)的C區(qū)。人和鼠Cκ距最后一個Jκ基因片段約2.5kb。Vκ與Cκ之間以隨機的方式發(fā)生重組連接。人κ輕鏈V基因的排列多樣性約為100Vκ×5Jκ=500。

（二)λ鏈基因的結(jié)構(gòu)和重排

小鼠Igλ輕鏈基因結(jié)構(gòu)見表3-4。在大多數(shù)近交系小鼠中，有4個J_λ和4個C_λ，根據(jù)其在胚系DNA上的分布位置可分為兩組（cluster):J_λ2C_λ2J_λ4C_λ4(C2-C4組)和J_λ3C_λ3J_λ1C_λ1（C3-C1組)，每組基因片段長約為5kb。

表3-4　λ鏈基因結(jié)構(gòu)和編碼的氨基酸

λ基因組中共含有V_λ1、V_λ2和V_λx3個V_λ基因片段，V_λ2與“C2-C4組”（J_λ2C_λ2J_λ4C_λ4)的5′端相距73kb；V_λ1與“C3-C1組”（J_λ3C_λ3J_λ1C_λ1)相距19kb；V_λX與V_λ23′端相距19kb；V_λ重因片段與J_λ、C_λ基因片段的連接并不完全隨機，V_λ1與J_λ3或J1重排，組成V_λ1J_λ3C_λ3基因或V_λ1J_λ1C_λ1基因，而V_λ2似乎只與J_λ2重排組成V_λ2J_λ2C_λ2基因，偶爾可見V_λ2與J_λ3或J_λ1重排，分別組成V_λ2J_λ3C_λ3基因和V_λ2J_λ1C_λ1基因。J_λ4、C_λ4不具備功能。目前尚未發(fā)現(xiàn)V_λ1與J_λ2重排。V_λX只發(fā)現(xiàn)與J_λ2重排。

在人類，λ基因位于第22號染色體，V_λ約有100個，不同亞型含C_λ數(shù)量在6～9個之間，每個C_λ與各自的J_λ基因片段相鄰。λ輕鏈的轉(zhuǎn)錄過程是某一個V_λ基因片段與某一個J_λ片段連接成V_λ/J_λ外顯子，然后與鄰近C_λ基因片段重組轉(zhuǎn)錄為初級mRNA，再通過mRNA的剪接、翻譯及修飾，成為成熟的λ輕鏈。

圖3-11　小鼠κ輕鏈基因重排順序、轉(zhuǎn)錄和合成

三、免疫球蛋白基因表達的調(diào)節(jié)

（一)核因子對Ig基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用

Ig基因轉(zhuǎn)錄活性是由兩個順式作用組件（cis-acting elements)即啟動子（promoter,P)和增強子（enhancer,E)來調(diào)節(jié)。而啟動子和增強子的功能又由反式作用的核因子（trans-acting nuclear factor)所控制。這些核因子也稱為DNA結(jié)合蛋白（DNA-binding proteins,DBP)，結(jié)合到啟動子或增強子內(nèi)特異的核苷酸序列，從而抑制或刺激啟動子和增強子的活性。許多種類細胞受到某些刺激后可誘導或活化特定的DBP。

1.ATGCAAAT序列及其核因子　Ig重鏈啟動子含有8個保守的核苷酸序列ATGCAAAT，這個序列也存在于κ輕鏈的啟動子、重鏈增強子以及許多非Ig的啟動子中。B細胞Ig基因的轉(zhuǎn)錄依賴于啟動子中這一完整的ATGCAAAT序列的存在。哺乳動物細胞中至少存在三種特異性結(jié)合ATGCAAAT的蛋白質(zhì)，即Oct1、Oct2(OTF2A)和OTF2B。Oct1又稱OTF1(octamer transcription factor 1),廣泛存在于哺乳動物的細胞中；OTF2A和OTF2B為淋巴細胞特異性，活化Ig基因的轉(zhuǎn)錄。

2.GGGACTTTCC序列和NF-κB　小鼠κ鏈增強子含有GGGACTTTCC10bp 的序列，是一種稱之為NF-κB(nuclearfactor of kappa B)DNA結(jié)合蛋白結(jié)合的靶序列。

（1)NF-κB結(jié)合靶序列的分布：NF-κB結(jié)合的DNA序列也存在于許多其它淋巴細胞、非淋巴細胞、病毒基因增強子和啟動子以及HIV-1的長未端重復序列中，如某些MHCⅠ類基因，IL-2Rα鏈,TCRβ鏈,IL-2、IL-3、IL-6、IFN-α、IFN-β、IFN調(diào)節(jié)因子、GM-CSF、SV40基因等。在不轉(zhuǎn)錄κ基因的前B細胞（pre-b cell)系中無NF-κB活性，這些細胞用LPS處理后可誘導出有功能的NF-κB，隨之也刺激κ鏈基因的轉(zhuǎn)錄。

（2)NF-κB結(jié)構(gòu)及作用特點：NF-κB是一個異源四聚體復合物，包含兩個與DNA結(jié)合的50kDa多肽和兩個不與DNA直接結(jié)合的65kDa多肽鏈NF-κB解離常數(shù)在10^-12～10^-13M之間，這種高親和力是它發(fā)揮功能所必需的。在大多數(shù)細胞系中由于抑制因子IκB與p65的偶聯(lián)作用，使整個NF-κB分子以無活性的形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)。IκB由于磷酸化（如PKC作用)或其它的修飾作用喪失功能，從NF-κB/IκB復合物上解離下來，洲離的NF-κB隨即進入細胞核，結(jié)合靶基因的特定序列，從而激活這一基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如抗原結(jié)合到B細胞mIg后刺激B細胞內(nèi)PKC活化。LPS也可活化PKC。NF-κB在有效合成κ鏈的骨髓瘤細胞中是無活性或是缺乏的，提示NF-κB和κ鏈基因的增強子在B細胞分化早期對于起始κ基因轉(zhuǎn)錄是需要的，但對于分化后期維持轉(zhuǎn)錄過程中并不是必需的。

圖3-12　免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)

注：VDJ重排使啟動子（P)靠近位于Jκ和Cκ之間的增強子，增加了已重排V2基因的轉(zhuǎn)錄水平，DNA結(jié)合蛋白NF-κB結(jié)合到增強子內(nèi)靶序列，Oct1、Oct2可結(jié)合到啟動子上。

（二)等位基因排斥現(xiàn)象

免疫球蛋白基因表達中一個重要的發(fā)現(xiàn)是等位基因排斥現(xiàn)象（allelic exclusion)。編碼人Ig重鏈基因位于第14對染色體上，在B細胞發(fā)育過程中，這一對同源染色體中僅有一條染色體Ig基因得到表達。例如一個人B細胞內(nèi)來自母本的染色體上的Ig重鏈基因得到表達，則來自父本的第14號染色體的Ig重鏈基因受到抑制而不表達。這可能是通過已發(fā)生有效重排的染色體產(chǎn)生反饋抑制（feedbackinhibition)信號抑制另一條同源染色體上的Ig重鏈基因發(fā)生重排。一條染色體上Ig重鏈基因的有效重排，一方面抑制了另一條同源染色體重鏈基因的重排，另一方面可發(fā)出信號使第2號染色體上Igκ輕鏈基因發(fā)生重排，如果一對同源染色體上的κ輕鏈基因重排均無效，才發(fā)生22號染色體λ輕鏈基因重排，這種現(xiàn)象稱為輕鏈同種型排斥現(xiàn)象（light chain isotype exclusion)。

四、免疫球蛋白的多樣性

機體對外界環(huán)境中眾多抗原刺激可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，有人推算抗體的多樣性在10⁷以上，這種抗體多樣性主要是由遺傳控制的。引起免疫球蛋白多樣性的原因主要有以下幾個方面。

1.胚系中眾多的V、D、J基因片段　胚系（germ line)中未重排的（unrearranged) DNA有眾多的V基因片段以及一定數(shù)量的D、J基因片段。以小鼠為例。V_H、D_H和J_H基因片段分別為1000、12和4，單獨重鏈重組的多樣性可達4.8×10⁴左右；Vκ和Jκ分別約為250和4，κ輕鏈V-J重排的多樣性為1.0×10³。經(jīng)重鏈與κ輕鏈隨機配對后推算的多樣性為（4.8×10⁴)×（1.0×10³)=4.8×10⁷。

表3-5　小鼠Ig胚系基因片段和重鏈、κ輕鏈配對的多樣性

注：多樣性數(shù)目不包括VDJ連接多樣性、N區(qū)插入和體細胞突變所增加的多樣性數(shù)目。

2.VDJ連接的多樣性　輕鏈基因重排過程中，V_J連接點以及重鏈基因重排過程中D-J以及V-D-J連接點有一定的變異范圍。例如輕鏈V_L因片段3′端5個核苷酸CCTCC和J_L基因片段5′端4個核苷酸GTGG連接時，9個核苷酸中只有6個核苷酸編碼輕鏈第95、96位氨基酸，可產(chǎn)生8種不同的連接方式（圖3-13)。

3.體細胞突變（somatic mutation)　體細胞在發(fā)育過程中可發(fā)生基因的突變。以長期體外培養(yǎng)的B細胞前體為例，每個細胞每個堿基對的突變率為1～3×10^-5，這種類型突變主要發(fā)生在V基因。體細胞突變擴展了原有胚系眾多基因片段的多樣性。

4.N區(qū)的插入（insert of N region)　在Ig重鏈基因片段重排過程中，有時可通過無模板指導的機理（non-temple directed mechanism)在重組后D基因片段的兩側(cè)即V_H-D_H或D_H-J_H連接處插入稱之為N區(qū)的幾個核苷酸。N區(qū)不是由胚系基因所編碼。在N區(qū)插入前，先通過外切酶切除V_H-D_H或D_H-J_H連接處的兒個堿基對，然后通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)連接上N區(qū)。由于額外插入了N區(qū)，可發(fā)生移碼突變（frameshift mutation),使插入部位以及下游密碼子發(fā)生改變，從而編碼不同的氨基酸，增加了抗體的多樣性。

圖3-13　輕鏈基因V-J連接多樣性舉例

圖3-14　N區(qū)插入D-J連的接處（示意圖)

5.輕鏈重鏈相互隨機配對　如表3-5所示，小鼠重鏈與κ輕鏈隨機配對后推算的多樣性可達4.8×10⁷，如果再加上重鏈與λ輕鏈的隨機配對其多樣性就更多了。