A群腦膜炎球菌多糖菌苗系用A群腦膜炎球菌液體培養(yǎng)后，經(jīng)提純獲得的多糖抗原凍干制成。供預(yù)防A群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎之用。
1 菌種
1.1 菌種來源
制造用的菌種及檢定菌種用的各種診斷血清，由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。
1.2 菌種檢定
1.2.1 形態(tài)及培養(yǎng)特性
將待檢的菌種接種在含10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基上，腦膜炎球菌在25℃不生長(zhǎng)。35～37℃二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)16～20小時(shí)，涂片鏡檢應(yīng)為革蘭氏陰性雙球菌，亦可有單個(gè)陰性球菌。平皿分離培養(yǎng)顯現(xiàn)光滑、濕潤(rùn)、灰白色的菌落、菌苔易取下，在生理鹽水中呈均勻混懸液。
1.2.2 生化反應(yīng)
接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、果糖及蔗糖，于35～37℃培養(yǎng)5～7日，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。
1.2.3 血清學(xué)特性
將在35～37℃培養(yǎng)16～20小時(shí)的菌苔，混懸于0.5%（ml /ml)甲醛生理鹽水中，或56℃加熱30分鐘殺菌后，使每ml含菌10億～20億，與同群血清做定量凝集反應(yīng)，放置35～37℃過夜，次日再放置室溫2小時(shí)觀察結(jié)果，以肉眼可見清晰凝集現(xiàn)象之血清最高稀釋度（+)為凝集反應(yīng)效價(jià)，必須達(dá)到原血清效價(jià)之半。
1.3 菌種保存
1.3.1 菌種應(yīng)凍干保存。凍干后抽樣按上述各項(xiàng)要求進(jìn)行檢查，合格后可作為種子批菌種用于生產(chǎn)。
1.3.2 種子批菌種可低溫保存或置2～8℃冰箱中，生產(chǎn)前應(yīng)檢查菌種的全部特性，合格后方可用于生產(chǎn)。
2 制造
2.1 菌種
將生產(chǎn)用種子批菌種啟開后，接種在10%羊血瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，放35～37℃二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)一般不超過18小時(shí)，第2～4代菌種可用適宜的固體或液體培養(yǎng)基，35～37℃固體培養(yǎng)基培養(yǎng)不超過18小時(shí)，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)不超過12小時(shí)。菌種自啟開后最多不能超過5代。
2.2 培養(yǎng)基
生產(chǎn)多糖菌苗可選用適宜培養(yǎng)基。生產(chǎn)用的液體培養(yǎng)基不應(yīng)含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。培養(yǎng)基中不應(yīng)含有對(duì)人體有害或其他過敏物質(zhì)。
2.3 培養(yǎng)
采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。培養(yǎng)物于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后或靜止期前期收獲。一般培養(yǎng)6～8小時(shí)（隨菌種接種量及使用培養(yǎng)基種類的不同而異)為宜。
2.4 殺菌
培養(yǎng)物加入甲醛溶液殺菌，或加熱56℃10分鐘，以確保殺菌完全及不損傷流腦多糖為宜。
2.5 去核酸
殺菌完成后，離心去菌體收集上清液，于其中加入十六烷基三甲溴化銨，充分混勻形成沉淀。放置適當(dāng)時(shí)間離心，收集沉淀物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，使其最終濃度為1mol/L，搖動(dòng)或攪拌1小時(shí)，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25%（ml/ml)。冷庫靜置1～3小時(shí)或過夜，離心去沉淀，收集澄清的上清液。
2.6 沉淀多糖
于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80%（ml /ml)，充分振搖。使多糖沉淀，離心收集沉淀多糖，然后用無水乙醇及兩酮各洗二次以上，將沉淀物（多糖粗制品)保存在-20℃以下待進(jìn)一步提取。
2.7 多糖的精制
將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10～20mg/ml，然后按1∶2容量用冷酚（100g結(jié)晶酚溶于40ml1∶10飽和醋酸鈉溶液)提取2～3次，提取時(shí)充分振搖。然后離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或適宜的溶液透析。必要或有條件時(shí)也可用其他方法去除內(nèi)毒素活性。再加乙醇至最終濃度為75%～80%（ml /ml)。離心收集沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗二次以上。離心后傾去上清液，用無熱原蒸餾水溶解沉淀的多糖，所得溶液即為提取之多糖，經(jīng)除菌過濾后，取樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)及各項(xiàng)生化測(cè)定。提取過程應(yīng)盡量在15℃以下進(jìn)行。提純多糖應(yīng)保存在-20℃或以下。
3 半成品檢定
3.1 化學(xué)測(cè)定
按《生物制品化學(xué)檢定規(guī)程》進(jìn)行。每批多糖應(yīng)測(cè)定固體總量，計(jì)算干重。
3.1.1 蛋白質(zhì)含量
每批提純多糖抗原的蛋白質(zhì)含量（按重52667788.cn/shiti/量)應(yīng)小于10mg/g。按Lowry法，用牛血清白蛋白作對(duì)照。
3.1.2 核酸含量
每批提純多糖的核酸含量（按重量)應(yīng)小于10mg/g。按分光光度法，核酸在260nm處的吸收系數(shù)（E1%1cm)為200。
3.1.3 O-乙�；繙y(cè)定
每批提純多糖的O-乙酰基含量應(yīng)≥2mmol/g。按Hestrin法測(cè)定。
3.1.4 磷含量
每批提純多糖的磷含量應(yīng)≥80mg/g。用鉬酸胺法測(cè)定。
3.2 分子大小測(cè)定
每批提純多糖的分子大小應(yīng)用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過濾法測(cè)定。Kd值應(yīng)≤0.40。kd值在0.5以前的洗脫液多糖回收應(yīng)在65%以上。
3.3血清學(xué)特異性試驗(yàn)
每批提純多糖應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)（或其他適宜方法)進(jìn)行血清學(xué)特異性試驗(yàn)。A群半成品多糖抗原在抗A群腦膜炎球菌抗體存在下，應(yīng)特異抑制A群腦膜炎抗原致敏的紅血球凝集。
3.4 提純多糖的蛋白、核酸及脂多糖含量若達(dá)不到要求可進(jìn)行再處理。
4 提純多糖稀釋
可用單批或多批多糖合并，然后加入無菌乳糖和無菌蒸餾水（無熱原)稀釋，使每人份菌苗含多糖30μg，乳糖2.5～3.0mg。乳糖規(guī)格應(yīng)為分析純結(jié)晶體。
5 分裝與干燥
分裝及容器的要求同《生物制品分裝規(guī)程》。
6 成品檢定
6.1 鑒別試驗(yàn)
每批分裝菌苗至少取一瓶進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，按3.3項(xiàng)方法進(jìn)行。
6.2 多糖濃度
每批菌苗應(yīng)檢查多糖含量，每人份多糖應(yīng)不少于30μg。磷含量應(yīng)在2.25μg以上。
6.3 無菌試驗(yàn)
每批菌苗應(yīng)按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
6.4 安全試驗(yàn)
6.4.1 熱原質(zhì)試驗(yàn)
每批菌苗應(yīng)按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，家兔注射劑量為0.025μg/kg。判定標(biāo)準(zhǔn)按該規(guī)程4.2項(xiàng)要求進(jìn)行。
6.4.2 毒性試驗(yàn)
6.4.2.1 豚鼠毒性試驗(yàn)
至少用5只體重350～400g的豚鼠，每只腹腔注射500μg多糖（1ml)，觀察7天，不應(yīng)引起明顯癥狀或死亡。
6.4.2.2 小白鼠毒性試驗(yàn)
至少用5只體重18～20g的小白鼠，每只腹腔注射100μg多糖（0.5ml)，觀察7天，不應(yīng)引起明顯癥狀或死亡。
6.5 分子大小測(cè)定
分裝的菌苗至少5批抽一批測(cè)多糖分子大小，用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過濾法測(cè)定，kd值應(yīng)≤0.40。kd值在0.5以前的洗脫液多糖回收率應(yīng)在65%以上。
6.6 水分測(cè)定
每批菌苗應(yīng)測(cè)水分（費(fèi)休氏法)，其含量應(yīng)不超過3%。
7 菌苗稀釋液檢定52667788.cn
稀釋菌苗用的pH6.8～7.2緩沖生理鹽水應(yīng)經(jīng)過下列檢定。
7.1 無菌試驗(yàn)
每批稀釋液應(yīng)按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
7.2 安全試驗(yàn)
每批稀釋液用體重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml，觀察7天，應(yīng)健存。
7.3 熱原質(zhì)試驗(yàn)
按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
8 保存與效期
半成品多糖保存于-20℃或以下，自收菌之日起效期為5年。凍干菌苗保存于2～8℃，自凍干之日起效期為2年。
