中國幽門螺桿菌研究:ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體

1983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門螺桿菌（Hp)之后，Hp與胃炎、消化性潰瘍的相關性引起人們極大的興趣。人們推測其可能成為這類疾病的致病因素之一。許多研究者正進一步探索其致病機理，并從不同角度尋找快速、可靠的檢測方法。迄今為止，檢測Hp的方法包括組織標本培養(yǎng)，切片染色，細菌直接涂片染色，快速尿素酶測定及¹³C尿素呼吸試驗和¹⁴C尿素呼吸試驗等。除尿素呼吸試驗外其余方法均需通過胃鏡檢查才能完成，鑒于取材困難，進一步尋找檢測Hp感染的免疫學方不進非常必要的。國外有人用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)檢測臨床病人血清中有Hp抗體報道，國內尚未有這方面研究報告。本文報道建立一種檢測人體抗Hp抗體的ELISA的實驗結果及與細菌培養(yǎng)法和尿素酶測定法對比檢測結果，研究證明本法特異、敏感、適用于大量標本普查和及時判斷治療反應，現(xiàn)將結果報告如下。

1　材料和方法

1.1　材料

①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三廠產(chǎn)品。②酶聯(lián)板離心籃：根據(jù)40孔酶聯(lián)板本實驗室自行設計制成。③DG—Ⅰ型酶聯(lián)免疫檢測儀：南京華東電子管廠產(chǎn)品。④試劑：過氧化物酶（HRP)，R²＝3.2，美國Sigma公司產(chǎn)品。鄰苯二胺（OPD)：上海白鶴化工廠產(chǎn)品，按文獻配制。包被液：取碳酸鈉1.59g加碳酸氫鈉2.93g，蒸餾水1000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液100ml＋2％小牛血清＋4％聚乙二醇（PEG)。封板液：5％小牛血清。戊二醛固定液：25％戊二醛液，100ml裝，Kochligh進口分裝，用時稀釋成0.25％戊二醛固定液。終止液：2NH₂SO₄。⑤抗原的制備：將澳大利亞皇家佩思醫(yī)院的Hp標準菌株（NCTC11638)及從胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板，37℃培養(yǎng)5d后取菌落作生化與血清學鑒定（自制兔抗Hp抗體)，然后取單個菌落移種于另一血平板，繼續(xù)培養(yǎng)3d，經(jīng)鑒定后將其大量增殖培養(yǎng)，3d后將菌苔刮下，置生理鹽水中制成菌液，加福爾馬林固定（0.1％～0.3％)，4℃過夜，3000r/nin離心30min，沉淀3次，將最后1次沉淀懸于少量PBS液內，用比濁管沒出細菌濃度，制成含菌3×10⁹ml，置冰箱冰凍，反復凍融3次，經(jīng)顯微鏡檢查無菌體存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，－20℃保存?zhèn)溆�。⑥臨床血清標本：采自胃鏡檢查患者，隨機采取1988年8～10月胃鏡檢查病人共38人，抽靜脈血2ml，分離血清貯存－20℃?zhèn)溆�。⑦陰性對照血清，進行ELISA測定，取其平均OD值作對照。⑧酶標羊抗人IgG結合物（SAHIgG—HRP)的制備：按過碘酸鹽改良法，略加改進標記制成酶標抗體。即HRP8.0ml，22℃較攪20min。加乙二醇6滴，繼續(xù)攪拌5min，對pH4.2，0.001mol/L醋酸鹽緩沖液（用2molHC1調pH)透析過夜，中間換水4次，加羊抗人IgG（上海生物制品研究所產(chǎn)品)14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸鹽緩沖液，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h，加硼氫化鈉（4mg/ml)0.2ml，置4℃2h，對pH7.2，0.01molPB－0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡。換水4次，收取透析袋內結合物，以50％飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后，測定精制結合物，E/P克分子比值合格后，將結合物小瓶分裝置－20℃保存，備用。⑨尿素酶測定法和Hp的分離培養(yǎng)法參考文獻進行。

1.2　方法

并稍加改進，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×10⁸億/ml（含蛋白8.6μg)稀釋后，每孔加100μ，離心籃離心20min2000r/min后，倒去孔內液體，然后加入0.25％戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗滌液洗3次（每次3min)，加5％小牛血清液，200ml/孔，經(jīng)37℃30min封板后倒去孔內液體。每孔加待檢血清(1：100稀釋)100ml，37℃保溫1h后，如上洗滌3次，同時做陰性對照孔和空白孔。之后于各孔內加和新鮮稀釋的酶標羊抗人IgG結合物100ml，37℃保溫半小時，于各孔中加入2NH₂SO₄50μl終止反應后，于酶聯(lián)測定儀以波長490nm測定OD值，將測得標本OD值（P)與陰性對照OD值（N)比（P/N)，若P/N比大于或等于2.0為陽性。

2　結果

2.1　ELISA的建立

為了知道所制備的SAHIgG－HRP在是接ELISA中的活性（結合第一抗體，效價)，將此酶標抗體稀釋成1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，1：256000，1：512000六種濃度，將作第一抗體的已知病人Hp感染陽性血清稀釋成1：100包被微板的Hp抗原濃度為2×108mg/ml，按上述步驟和主法進行ELISA試驗。結果表明，所標記的羊抗人IgG酶標抗體當稀釋度為1：32000～1：512000時，它們的P/N值均為≥2.0，因此，了保證實驗結果穩(wěn)定采用個單位效價，即用1：256,000稀釋度作正式實驗（注1：512000為一個效價單位)。

為了解Hp抗原在包被微量滴定板中最適濃度，將Hp抗原用抗原包被液分別按蛋白濃度稀釋成0.27，0.54，1.08，2.15，4.3，52667788.cn8.6，17.2及34.4μg/ml8種濃度，然后分別進行包被，與第一抗體陽性血清(1：100)和SAHIgG—HRP(1：256000)按上述步驟和方法進行ELISA試驗。結果，當Hp抗原濃度為8.6～17.2％μg/ml時OD值最高，Hp抗原在34.4μg/ml時，OD值下降，因此Hp抗原包被量最適濃度為.8.6～17.2μg/ml。以后實驗用此抗原濃度包板。

為了確定用ELISA測定病人抗Hp抗體的陽性血清濃度，用Hp抗原8.6μg包板，SAHIgG—HRP仍用二個單位（1：256000)，將二份陽性血清混后后稀釋成1：50，1：100，1：200，1：400和1：800五種濃度進行ELISA試驗，測定OD值的結果。結果顯示陽性血清稀釋度與OD值呈較好的線性關系，當血清稀釋度為1：50時OD值為1.521，1：100時OD值是1.172，P/N比值均大于2.0，故以后實驗中第一抗體的血清濃度均用1：100的稀釋度。

為了驗證ELISA間接法用于檢測Hp抗體的特異性，進行特異性吸收試驗。選用8份Hp感染性血清以1：50稀釋，加等量Hp菌懸液，混勻置37℃半小時，再置4℃過夜吸收后離心取上清液按上述實驗條件和方法進行ELISA測定，結果見表1。

表1　特異吸收抑制試驗結果

從表1結果可知，陽生血清經(jīng)吸收1次后，OD值均較吸收前下降，特別8號血清前后相比下降了50％，由此均顯示特異吸收抑制試驗陽性，證明該8份陽性血清的抗Hp抗體是特異的。為了探索所建立的ELISA間接法檢測抗Hp抗體的敏感度，選擇6份抗p陽性血清按上述實驗條及方法進行ELISA檢測，同時與試管凝集試驗和顯微凝集試驗進行比較，結果見表2。

表2　ELISA測定Hp抗體敏感比較結果

數(shù)字為稀釋倍數(shù)的倒數(shù)

從表2結果表明，6份抗Hp抗體陽性血清用所建立的ELISA間接法測出的抗體效價均＞1：800，試管凝集試驗測出的抗Hp抗體效價為1：160～1：640，顯微凝集試驗測出的抗Hp抗體效價為1：160～1：320，顯然ELISA法比后兩者方法敏感的多。

批內誤差　將4份陽性血清標本在同一塊板上按上述方法重復進行9次ELISA試驗，計算各份標本檢測OD值結果的變異系數(shù)（表3)。

表3　4份陽性血清重復9次ELISA檢測(x)

從表3得知，批內誤差范圍是5.5％～8.1％，平均6.87％，顯示按上述實驗條件建立的檢測Hp抗體的間接法ELISA的穩(wěn)定性好，重復性佳。

批間誤差　將5份陽生血清，按上述方法及實條件在1W內反復進行3次ELISA，計算各份標本檢測OD值結果的變異系數(shù)（表4)。結果指出三批陽性標本的變異系數(shù)在0.74％～8.12％之間，平均4.67％，由此亦顯示按上述實條件建立的檢測Hp抗體的間接法ELISA重復性和穩(wěn)定性均良好。

2.2　臨床標本檢測結果

將胃鏡檢查患者的血清以1：100稀釋，用上述實驗條件建立的ELISA間接法進行，Hp抗體（ELISA－HpAb)檢測，同時將同一患者胃粘膜進行Hp分離培養(yǎng)（HpC)和Hp尿素酶測定（HpUT)，以資比較（表5)。

表4　5份陽性血清標本進行ELISA的批間誤差試驗結果

表5　ELISA法培養(yǎng)法和尿素酶法對比

表5結果指出，ELISA－HpAb法的陽性數(shù)為34/38（89.4％)，Hp培養(yǎng)法的陽性數(shù)23/38（60.5％)，HpUT法的陽性數(shù)為22/38（57.9％)，表明ELISA－HpAb法敏感性較另二法都高（ELISA與CP培養(yǎng)法比較X²＝8.94，P＜0.01。ELISA－HpAb與HpUT比較X²＝9.77，P＜0.01。)38例患者用ELISA－HpAb法與培養(yǎng)法（HpC)和HpUT法結果符合率比較，結果見表6及表7。

表6　ELISA－HpAb法與HpC法符合率比較

表7　ELISA－HpAb法與HpUT法符合率比較

表6及表7比較結果表明，ELISA－HpAb與HpC法的總符合率為65.80，與HCPUT法總符合率為68.4％。在ELISA－HpAb法的34例陽性中HpC法和HpUT法的23例及22例陽性中，ELISA－HpAb法只有一例未檢出，由此均表明，ELISA－HpAb法比HpUT法敏感。

3　討論

關于診斷Hp病的血清學方法，至目前為止主要有補體結合試驗，被動血凝集試驗，細菌凝集試驗等法。但由于這些方法操作繁鎖，或敏感性低，或可靠性欠佳，故現(xiàn)已較少采用。自ELISA法建立以來，證明具有敏感性高，穩(wěn)定性強等優(yōu)點，國外報道已有人用此法來檢測人血清中抗Hp抗體，也證實特異、敏感。但國內尚未有報道證實此法能否用于Hp抗體的檢測和診斷Hp感染。本文報道所建立的檢測Hp抗體的間接ELISA法實驗和初步用于臨床標本檢測結果證實具有較好的特異性，敏感性（比試管凝集和顯微凝集試驗敏感＜2～3倍)和重復性。為快速診斷Hp提供較好的方法（表1～7)。然而其中操作步驟除按文獻報道的一般流程（Hp抗原包被微板→甲醛固定→封閉（牛血清白蛋白)→人Hp抗體溫育→羊抗人IgG酶標抗體溫育→底物顯色→酶聯(lián)測定儀測定)外，作了若干改進：①Hp抗原的制備：根據(jù)文獻報告，抗原的制備有超聲粉碎，福爾馬林固定處理等方法。但Goodwin等認為經(jīng)過鹽酸—甘氨酸制成的可溶性抗原應用于ELISA更加可靠。本文采用抗原是經(jīng)過福爾馬林殺死和固定，用PBS洗三次，置冰箱反復凍融3次后制成的Hp抗原，用蛋白濃度為8.6μg/ml包被微板亦可獲得滿意結果。②通過2000r/min，20min離心沉淀，戊二醛合固定30min的抗原代替過夜包被同樣得到滿意結果。③檢測血清標本陽性的稀釋度（陽性www.med126.com滴度或陽性單位)：Goodwin等的報告，用ELISA檢測病人血清抗Hp抗體的滴度認為在＞1：300（或＞300EU)與Hp的胃疾患非常接近。本文通過選擇10歲以下兒童血清作正常對照和已知Hp陽性血清進行ELISA試驗，根據(jù)P/N≥2的判定陽性標準原則結果表明以1：100以上（或＞100EU)作為陽性血清標本6份滴度較高的與試管凝集和顯微凝集試驗對比測定，結果表明，在后二者方法中，均有1：320的抗Hp抗體（表2)。由此也證明用兒童血清作正常對照用用此判斷陽性標準是可靠的；同時證實這些病人血清中確實有較高抗Hp抗體。但是，此等判定陽性標準是否非常合適還待進一步實踐證實。

ELISA－HpAb法與HpC法和HpUT法的結果比較，前者比后二者的陽性數(shù)高（89.4％)，符合率分別是65.8％和68.4％（表5)。但常規(guī)培養(yǎng)法需時3d～7d，HpUT法較快速，但受活檢粘膜內菌量多少及取材部位影響較大，短暫停留在胃內的腸道菌易造成假陽性結果。因此特異性不如ELISA－HpAb法。但是，ELISA－HpAb法與HpC和HpUT法檢出的陽性病例數(shù)與胃鏡檢查的診斷和病理診斷是否完全相符，有待進一步的研究和分析。