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摘要: 酪氨酸酶是黑素合成的關鍵酶，可能是白癜風自身免疫的重要抗原。最近發(fā)現(xiàn)部分白癜風患者血清中有酪氨酸酶抗體，且與白癜風臨床類型和分期密切相關。提示自身免疫性白癜風發(fā)病機制與酪氨酸酶抗體水平有關，為其免疫治療提供依據(jù)。酪氨酸酶抗體可以作為白癜風活動性的一個指標。
酪氨酸酶（TYR）是一種75kD含銅酶，來源于胚胎神經(jīng)峭細胞，是黑素代謝和兒茶酚胺的關鍵酶。Spritz等[1]證實人TYR是一種銅結合蛋白，有銅A和銅B位點。離子銅特異性能與人TYR結合，一個位點的銅結合可以促進另一個位點的銅結合。組氨酸在銅B位點協(xié)調其結合。TYR的多肽鏈的適當折疊對銅結合及其催化活性是關鍵性的，TYR突變可中斷銅結合使其催化活性喪失。眼、皮膚白化病是由于TYR基因突變所致，該病TYR陽性患者色素性皮膚損害發(fā)生率高[2]。超氧化物負離子（O2-）能穿透黑素細胞（MC）入胞內，TYR通過利用O2-保護MC，免受O2-細胞毒作用[3,4]。在黑素瘤患者黑素瘤細胞（MMC）和MC中抗氧化系統(tǒng)失衡，內源性反應性氧生成，細胞內不能抵御內源性超氧化物的攻擊[5]。白癜風患者血清中TYR抗體的生成，提示白癜風的發(fā)病與自身免疫有關。
一、酪氨酸酶的抗原性
酶是多種自身免疫紊亂性疾病的自身抗原[6]，TYR作為抗原必需具備下列條件：①酶活躍性；②免疫原性；③能誘導識別自身的抗體。
TYR能暴露于免疫系統(tǒng)中，從惡性或正常色素細胞來源的TYR，可以作為自身抗體產(chǎn)物的靶抗原；TYR與蛋白酶等無交叉反應，提示抗TYR抗體對TYR是特異性的，MC能表達MHCⅡ類分子，可作為抗原遞呈細胞。人MMC能分泌TYR，TYR抗體在黑素瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)，其它惡性腫瘤患者血清中則沒有，提示惡性黑素瘤可產(chǎn)生抗TYR的抗體[7,8]，TYR基因編碼抗原能被黑素瘤細胞毒性T細胞（CTL）識別[9]，顯示系統(tǒng)免疫系統(tǒng)能對TYR發(fā)揮作用[10]。
哺乳動物黑素生成由多個基因位點共同參與調控。不同位點基因及相關蛋白具有多種特征性結構位點（B位點，C位點，S位點和P位點）。哺乳動物色素細胞調節(jié)基因有多種，這些基因的最大特點是定位于C位點（C-allbino locus），編碼TYR。鼠C位點基因長70kb，定位第7號染色體，人C位點基因長50kb，定位11號染色體。鼠及人C位點基因均含有5個外顯子和4個內含子。TYR是一種膜糖蛋白，可在MC中特異性表達。B位點（brown locus）基因編碼TRP-1（gp75）。鼠B位點基因長18kb，有8個外顯子和7個內含子，定位14號染色體。人B位點基因定位第9號染色體。TRP-1能在MC中表達且定位黑素體膜，具酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶活性。S位點（slaty locus）基因編碼TRP-2，小鼠S位點基因位于第14號染色體，為多巴色素異構酶。鼠及人P位點（Pmel-17 locus）基因編碼stablin蛋白，人及鼠P位點基因定位第10、12號染色體，參與黑素合成終末途徑的調節(jié)。
TYR、gp75、TRP-2結構相似，其基因產(chǎn)物有下列特點：①高同源性（氨基酸序列相同40％，相似45％）。②分子量幾乎相同。③三級結構有高度保守序列半胱氨酸殘基。④具有酶活性銅結合位點。⑤含有跨膜區(qū)。
TYR是黑素合成的關鍵酶，其已知的氨基酸序列含有一段前導信號肽和一個跨膜結構基元（motif），與黑素體膜上的錨定蛋白（anchorin）相一致。HLA-A2遞呈TYR抗原，不同的細胞毒性T淋巴細胞克隆識別具有活性基元的九肽LLAVLYCLL，說明TYR在不同個體的表達呈相當高的同源性。TYR的表達均一性優(yōu)于TRP-2，表達頻率亦較TRP-1高。除CD8+T細胞外，人CD4+T細胞也能特異性識別TYR基因編碼的相關抗原。黑素瘤患者中檢出TYR，TYR是MMC上的分化抗原�？勺鳛橹鲃用庖叩牧己每乖小YR既受MHC-Ⅰ限制，又受MHC-Ⅱ限制的黑素瘤共同抗原，誘生的CD8+T細胞和CD4+T細胞均能產(chǎn)生有效的抗腫瘤應答。TRP-1原位雜交證實編碼基因位于人第9號染色體q23區(qū)，為IgG抗體識別抗原，具有DHI-2羧酸氧化酶活性，非突變型TRP-1抗原可被HLA-A31特異性CTL識別。外源性TRP-1cDNA在MMC等中表達。gp100即MC/MMC特異性蛋白P mel-17，免疫電鏡證實gp100主要位于Ⅰ、Ⅱ期黑素體膜，廣泛表達于人MMC（50％）。HLA-A2 mMC的gp100可被自體腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）識別。識別部位是十肽LLDGTATLRL（aa457-486），從gp100提取的十肽能體外誘導TIL，將TIL細胞與IL-2配伍應用于HLA-A2+黑素瘤患者，可消除自發(fā)性黑素瘤的轉移灶。
二、酪氨酸酶抗體
�。ㄒ唬z測方法：TYR抗體在白癜風患者血清中檢出。Song等[11]1994年用細菌合成人TYR，免疫印跡法檢測TYR抗體。這種方法相對不敏感且不能定量檢測。Baharav等[12]1996年使用蘑菇TYR，ELISA法檢測TYR抗體，此法敏感，但所用蘑菇TYR與人TYR同源性低。而Xie等[13]1996年則用人MC提取物作為TYR的來源，免疫沉淀法等檢測TYR抗體。Kemp等[14]1997年采用放免法（RIA）檢測TYR抗體。近來此法已被用來檢測自身免疫性疾病患者血清中的特異性抗體[15-17]。這種方法能敏感定量檢測抗體。
�。ǘ┊a(chǎn)生、特點、特性：
1.抗TYR抗體的產(chǎn)生：用人TYR cDNA轉染L細胞，獲得L-TY細胞，免疫同源性C3H鼠，即用5×106L-TY細胞與等量Frend佐劑混合，腹膜內注入有6周鼠齡的雌性C3H鼠體內，每次間隔2周，第3，4次用5×106細胞裂解物與等量Frend佐劑混合免疫動物。第4次注射后3天，抽血，分離血清，同時用未轉染L細胞去除非特異反應性成分，結果用人TYR cDNA轉染L細胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只對TYR cDNA轉染L細胞的鼠血清抗體滴度＞10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠對L-TY細胞無反應性。用L-TY細胞免疫動物獲得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC細胞裂解物。免疫沉淀法可見分子量為70kD～80kD的寬幅條帶，可能為TYR生物合成中間代謝產(chǎn)物，未轉染L細胞，TYR陰性無色素MMC中未見特異性條帶。
2.免疫印跡法檢測TYR抗體：用抗TYR血清10-3稀釋度，在TYR轉染L細胞和有色素MMC可見細胞內顆粒染色，親代L細胞內無胞內染色，在L-TY細胞，細胞內染色顆粒位于核周和胞質內。無色素MMC，不表達TYR mRNA，無TYR活性，與TYR抗體無相互作用。有色素MMC和培養(yǎng)MC，高度表達TYR活性，黑素形成多，細胞質顆粒深度染色。
單克隆抗體TA99能識別TRP-1糖蛋白，TA99能與人有色素MMC表達的TRP-1和轉染L-GP細（用編碼TRP-1全長cDNA轉染鼠L細胞獲得）表達的全長人TRP-1cDNA相互作用，且免疫耗竭實驗證實TA99不耗竭能產(chǎn)生分子量為70kD～80kD條帶的抗TYR血清，免疫熒光分析抗TYR抗體與TRP-1，TYR l-GP細胞無相互作用，抗TYR抗體不沉淀來自L-GP細胞的TRP-1。
3.TYR抗體使TYR活性喪失：免疫鼠血清能沉淀鼠MMC，L-TY細胞裂解物，提示免疫鼠血清能滅活有色素MMC及L-TY細胞TYR的活性，加入L-多巴底物后，見黑素形成，提示TYR活性恢復，免疫沉淀時如用免疫前血清則無黑素形成[7]。
三、白癜風
白癜風與TYR抗體：TYR抗體在白癜風中常常發(fā)生。Song等[11]應用免疫印跡法檢測了26例白癜風患者血清，其中有16例（61％）可與重組TYR特異性結合。26例白癜風患者，有16例（61％）血清TYR抗體陽性，其中7例伴發(fā)非胰島素性糖尿病（IDDM）有4例（57％）、8例伴發(fā)橋本甲狀腺炎有4例（50％）、3例伴發(fā)Grave病有3例（100％）、7例伴發(fā)Addison病有4例（57％）陽性。Kemp等[14]應用35S標記人TYR，放免法（RIA）檢測白癜風患者血清TYR抗體。在被檢測的46例白癜風患者的血清中，5例（10.9％）TYR抗體陽性，20例對照血清及10例橋本甲狀腺炎患者血清陰性。Baharav等應用固相ELISA法檢測18例白癜風患者（彌漫性7例，局限性1例）血清中的TYR igG抗體滴度，結果（OD均值）彌漫性白癜風為0.658±0.251，局限性白癜風0.188±0.05，健康對照組0.093±0.049， 顯示彌漫性白癜風TYR igG抗體滴度較局限性白癜風及健康對照組顯著增高。這些TYR抗體與TYR的親和力高，與b位點基因產(chǎn)物TRP-1沒有交叉反應[12]。
大多數(shù)急性白癜風及黑素瘤患者有對MC、MMC的抗體，這些抗體在體外通過補體介導細胞毒作用和抗體依賴細胞毒作用殺傷MC。Cui等檢測發(fā)現(xiàn)30例黑素瘤患者血清有24例（80％）、29例白癜風患者血清有24例（83％）抗體陽性，而28例對照組只有2例（7％）陽性。人及動物黑素瘤中，白癜風的出現(xiàn)能改變其進程。用MMC免疫動物可誘發(fā)白癜風。重組抗MMC抗體對黑素瘤有效[18]。黑素瘤伴發(fā)白癜風時預后較好，白癜風患者抗體出現(xiàn)的頻率和水平與黑素瘤退變（regression）一致。提示抗白癜風和黑素瘤抗體作用于色素細胞（MC，MMC）上有相同的抗原，并且這些抗原能在MC和MMC上表達[19]。白癜風MC抗體既能溶解MC，致皮膚白斑形成，又能有效破壞MMC；MMC抗體也能與正常MC結合，誘導黑素瘤產(chǎn)生白癜風樣白斑，TYR抗體則是二者之間的橋梁。
白癜風患者血清MC抗體滴度與該病活動性和嚴重程度密切相關，50％局限性白癜風患者血清中有對MC的抗體，而彌漫性白癜風則高達93％，且彌漫性白癜風MC抗體能與MMC結合，抑制其增殖。在補體存在的情況下溶解細胞，減少體內鼠黑素瘤轉移，MMC上抗體表位滴度在白癜風較健康者及黑素瘤高。黑素體是黑素合成和貯存的亞細胞器，Ando等[20]認為黑素體數(shù)量變化與TYR mRNA水平有關。UVB上調TYR mRNA水平致皮膚色素沉著[21]。TYR和gp75都是黑素體轉膜糖蛋白，TYR抗體與gp75沒有交叉反應[22]。
白癜風患者血清含有抗MC抗體，MC抗體在Smyth雞模型中于脫色前數(shù)周被檢測到。近來黑素瘤患者血清中亦分離到TRP-1自身抗體，循環(huán)中的這些抗體被認為是導致Smyth雞色素脫失斑的主要原因[23,24]。白癜風患者血清中TYR抗體的檢出，進一步提示白癜風的分子發(fā)病機制，為臨床分型、分期、治療及預后提供依據(jù)。
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