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關鍵詞：肝干細胞
肝干細胞發(fā)現(xiàn)于20世紀50年代末，1956年，F(xiàn)arber［1］將肝內可能具有分化潛力的細胞描述為卵圓細胞，1958年Wilson和Leduc［2］提出肝干細胞的概念。近年來，人們發(fā)現(xiàn)肝干細胞移植對急慢性肝臟疾病有明確的治療作用，使之成為消化領域的研究熱點。本文對肝干細胞及干細胞移植治療肝病的研究進展做一綜述。
1 肝干細胞的來源與分類
根據(jù)肝臟干細胞起源的不同，可將其分為肝源性肝臟干細胞和非肝源性肝臟干細胞，前者包括卵圓細胞、分化的肝細胞、胚胎肝細胞和膽管上皮細胞，后者則為源于胚胎干細胞、骨髓造血干細胞及胰腺上皮干細胞等不同來源的肝臟干細胞。在特定條件下，造血干細胞和骨髓間充質細胞均可轉化成肝細胞。
1.1 胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞） ES細胞來源于早期胚胎,具有多項分化潛能,可以在體內或體外分化為多種組織細胞。Hamazaki等［3］在體外成功地將小鼠ES細胞定向分化為成熟的肝細胞,該細胞能表達AFP、甲狀腺轉運蛋白、A2抗胰蛋白酶、白蛋白等肝細胞特征。Hu等［4］則在直接觀察到體外ES細胞向肝細胞轉化的過程中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中體外ES細胞能轉化為可分泌AFP、ALB的肝細胞。
1.2 骨髓干細胞 骨髓中含有的造血干細胞和間充質細胞具有較強的增生、分化能力。Lagasse等［5］將骨髓組織細胞移植給致死量放射線照射鼠，發(fā)現(xiàn)在受鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)骨髓造血干細胞來源的成熟肝細胞，提示造血干細胞可以轉化為肝細胞。Theise等［6］將正常雄性小鼠骨髓移植到正常雌性小鼠體內，應用熒光原位雜交方法檢查雌性小鼠肝臟細胞Y染色體，發(fā)現(xiàn)雌性小鼠肝臟的部分肝細胞表達Y染色體，提示骨髓干細胞在正常肝臟環(huán)境中能分化為肝細胞。Petersen等［7］將雄性大鼠骨髓干細胞移植到致死量放射性肝損傷且肝細胞增生被抑制的雌性大鼠模型體內，發(fā)現(xiàn)該模型大鼠的部分肝臟細胞表達Y染色體，提示骨髓干細胞不僅在正常肝臟環(huán)境能分化為肝細胞，而且在肝臟某些病理的環(huán)境中也能分化為肝細胞。
1.3 胰腺上皮干細胞 胰腺中存在著肝臟前體細胞。Wang等［8］用野生型E.colilacZ轉基因小鼠胰腺細胞移植入同系酪氨酸代謝酶基因（FAH）突變的小鼠脾臟,在小鼠脾臟中能檢測到FAH（+）的肝細胞團。從胰腺分離的胰島前體細胞在體外培養(yǎng)中可分化為肝上皮細胞，提示在胚胎發(fā)育過程中,一些原始的多能干細胞保持著未分化狀態(tài)滯留在機體組織中。胰腺肝臟細胞同源性的這一特征，為進一步的臨床治療提供了又一肝干細胞來源。
1.4 肝干細胞
1.4.1 肝卵圓細胞（hepatic oval cell） 表現(xiàn)為核大而胞質小并具有特殊的細胞標記,細胞表面高度表達OV-6、白蛋白、CK等,形態(tài)呈卵圓形。卵圓細胞來自終末小膽管Hering管細胞,其數(shù)量與肝損傷的嚴重程度有關。在成年動物肝臟內肝卵圓細胞含量非常少,通常情況無法檢測到。
1.4.2 肝小細胞 與肝卵圓細胞類似,多在嚴重肝損傷的情況下,可觀察到肝小細胞增殖，該細胞直徑為9~12μm的小型單個核細胞,呈鋪路石樣增殖,其性質介于肝細胞與肝管上皮細胞之間。在急性病毒性肝炎、暴發(fā)性肝衰竭恢復期、慢性肝炎及肝硬化患者的肝組織中可以觀察到這種細胞。
2 各種干細胞分離方法
2.1 骨髓間充質干細胞的分離方法 骨髓干細胞主要有兩大類，一類是造血干細胞（hematopoietic stem cells,HSCs），它是血細胞的起源細胞，另一類是骨髓間充質細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）。骨髓中MSCs的含量很低，約為0.001%~0.01%，因此應用MSCs前，需對其進行分離及體外培養(yǎng)擴增。目前常用的分離方法為貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分離法，其中流式細胞儀分選是目前分離骨髓干細胞的最常用方法之一。
2.2 肝干細胞的分離方法 目前分選、純化肝干細胞的方法有密度梯度離心、流式細胞技術結合免疫熒光標記單克隆技術、免疫磁珠分選技術等,其中密度梯度離心無需特殊儀器及抗體，操作過程簡單，可減少復雜操作對細胞活性的損傷，采用protease E選擇性破壞肝實質細胞［9］，20μm濾膜濾過清除體積較大細胞，后經(jīng)Percoll密度梯度離心獲得高產(chǎn)量及活性率的肝干細胞。
3 急性肝損傷肝干細胞的激活與增殖
干細胞在肝損傷時具有分化增殖為肝細胞的能力，但給予正常及受損傷的動物干細胞治療時，發(fā)現(xiàn)只在受損傷的動物觀察到干細胞的分化與增殖，正常動物肝臟組織并無外源性干細胞生長跡象。說明細胞對于生長信號的反應因損傷的程度大小而異。正常肝臟中，肝干細胞處于休眠期，不分裂增生，當肝干細胞被激活后，必須在適宜的微環(huán)境中才能分化成熟。當部分肝細胞死亡和（或）暴露于有毒性物質時，卵圓細胞開始增生、分化為肝細胞，補充丟失或死亡的細胞。此外，造血干細胞只能在肝臟中分化為肝細胞和膽管上皮細胞。肝干細胞的擴增和分化是一個復雜過程，在該過程中，肝臟微環(huán)境和多種細胞因子、分化因子的表達起重要作用。Thorgeirsson等經(jīng)過一系列研究認為參與肝干細胞增生和分化的因子包括干細胞因子及其受體c-kit系統(tǒng)、干擾素γ，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）。另外，還包括與肝臟再生有關的生長因子:表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）、肝細胞生長因子（HGF）和成纖維細胞生長因子（FGF）家族等。國內姚鵬等［10］報道HGF,表EGF、FGP能促進骨髓干細胞的增生、分化，TGF-β能誘導骨髓干細胞的凋亡，而TNP-α、IL-6對骨髓干細胞的生長無明顯影響。目前很難確定促進和誘導肝干細胞分化及擴增的關鍵因素，這也是影響肝干細胞臨床應用的一個難題。
4 干細胞移植治療急慢性肝臟疾病
肝干細胞的移植方法較多，常用方法包括腹腔移植、脾移植、門靜脈移植、肝動脈移植等。目前，動物實驗進行較廣泛，各種途徑的移植應用于急慢性肝病的治療，而臨床上主要以肝動脈方式移植最為常用。
4.1 腹腔內移植 腹腔是干細胞移植最方便易行的治療方法，但由于其有效的作用主要是通過肝臟受損傷時干細胞提供的細胞因子的作用，而并非腹腔內干細胞的增殖與分化的作用。且受腹腔內干細胞分化、增殖條件的限制，基本無臨床應用前景。
4.2 脾內移植 Shi Z等［11］經(jīng)脾臟進行胚胎干細胞移植治療Wilson’s病模型鼠，移植后第2、4周，在肝內可見胚胎干細胞來源的干細胞增殖。說明脾臟內移植的胚胎干細胞有分化為成熟肝細胞的能力。蘇娟等［12］采用人胎肝干細胞在小鼠腹腔及脾內移植，移植后觀察結果證明了胎肝干細胞能在損傷肝臟中增殖并分化為肝細胞。移植在脾臟的干細胞雖然能在短期內達到改善肝功能的目的，但由于其不能在脾臟內形成有效的肝小葉等排泌結構，其依賴于脾臟內干細胞的分化，長期效果主要是來源于由脾臟回流到肝臟的干細胞的分化增殖。
4.3 門靜脈或肝內移植 理論上肝臟本身是肝細胞移植的最佳器官，因為門脈內含高濃度的嗜肝細胞因子和局部生長因子。Lagasse等［5］將純化正常小鼠的骨髓造血干細胞（HBSC）經(jīng)靜脈移植給有代謝性肝�。ɡ野彼嵫YⅠ型）的小鼠，發(fā)現(xiàn)能逆轉后者的肝功能、延長其壽命。Akushida T等［13］通過門靜脈進行干細胞移植治療Wilson’s病模型小鼠，移植后14天，肝內發(fā)現(xiàn)干細胞來源的肝細胞，而腹腔內移植則無此發(fā)現(xiàn)。Fan TX等［14］在此途徑進行干細胞移植時也有類似發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)干細胞可經(jīng)肝臟種植于脾及骨髓中。經(jīng)門靜脈移植的多篇文獻顯示，干細胞可在不改變器官微結構的情況下與受體肝實質相融合。但臨床應用中，移植后門靜脈及肝小靜脈血栓形成是影響其廣泛應用的又一障礙。
4.4 肝動脈移植 姚鵬等［15］采取患者自體骨髓分離純化骨髓干細胞，行肝動脈方式移植入肝臟中治療慢性肝功能衰竭。結果自體骨髓干細胞移植治療8周后，移植組患者臨床癥狀、肝功能和凝血機制明顯改善。張強等［16］報道同樣方法經(jīng)肝動脈自體骨髓干細胞移植治療肝硬化患者，結果20例患者中14例有效，6例無效，收到良好短期療效。由于臨床工作只是起步階段，但有效的臨床結果令人鼓舞。
5 肝干細胞移植治療肝病的展望
隨著肝干細胞研究的深入，以下問題的解決，可能會推動干細胞移植的臨床應用：（1）自體干細胞分離方法的簡化和體外擴增速度的加快，是決定其用于治療急性肝病的重要因素；（2）加強對干細胞誘導分化機制的研究，防止向腫瘤細胞分化；（3）移植途徑的簡單化，經(jīng)皮經(jīng)肝的門靜脈移植可能是治療肝病的最簡單的有效方法，如何預防移植后血栓的形成是一個較重要的課題；（4）進一步研究與干細胞嗜肝特性相關因子，最終達到經(jīng)外周血進行干細胞移植治療肝病的目的；（5）開展干細胞基因修飾后移植治療遺傳性疾病及其他基因異常疾病的研究。
總之，肝干細胞移植治療急慢性肝病治療的基礎與臨床研究均較活躍，隨著基礎研究的不斷深入與廣泛的臨床應用，在不遠的將來，干細胞移植治療將給患者帶來更大的福音。
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