二、組織學(xué)研究方法
�。ㄒ�)一般光學(xué)顯微鏡術(shù)
應(yīng)用一般光學(xué)顯微鏡（簡稱光鏡)觀察組織切片是組織學(xué)研究的最基本方法。取動(dòng)物或人體的新鮮組織塊，先用固定劑（fixative)固定（fixation)，使組織中的蛋白質(zhì)迅速凝固，防止細(xì)胞自溶和組織腐敗。常用的固定劑如灑精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化鋨等，一般常將幾種固定劑配制成混合固定液，以抵消或減弱單種固定劑對(duì)組織的收縮或膨脹等缺點(diǎn)，達(dá)到更好固定效果。固定后的組織塊（約3～5mm3大小)用石蠟、火棉膠或樹脂等包埋（embedding)成硬塊，以切片機(jī)（microtome)切成5～10μm厚的組織切片（tissue section)，切片貼在載玻片上經(jīng)脫蠟等步驟后進(jìn)行染色。組織塊也可立即投入液氮（－196℃)內(nèi)快速凍結(jié)，用恒冷箱切片機(jī)（cryostat)制成冷凍切片（frozen section)，這種方法制片迅速，細(xì)胞內(nèi)酶活性保存較好，常用于酶組織化學(xué)染色。血細(xì)胞和分離培養(yǎng)的細(xì)胞可直接涂在玻片上，制成涂片（smear)。疏松結(jié)締組織和腸系膜等軟組織可撕成薄片鋪在玻片上（鋪片)，牙和骨等堅(jiān)硬組織可磨成薄片（磨片)。組織切片等標(biāo)本經(jīng)染色、透明后，以封固劑和蓋片封固，即可長期保存，鏡下觀察。
圖1－1 堅(jiān)牢綠（酸性染料)與亞甲藍(lán)（堿性染料)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其染色反應(yīng)示意
染色（staining)是用染料使組織切片著色，便于鏡下觀察。天然和人工合成的染料甚多,它們都是含發(fā)色團(tuán)的有機(jī)化合物，當(dāng)染料具有助色團(tuán)成為鹽類物質(zhì)，即可溶解于水并具電荷，與組織有親合力，使組織著色。含氨基（－NH2)、二甲氨基〔－N（CH3)2〕等堿性助色團(tuán)的染料，稱堿性染料（basic dye)，它的鹽溶液具陽電荷；含羧基（－COOH)、羥基（－OH)或磺基（－SO3H)等酸性助色團(tuán)的染料，稱酸性染料（acid dye)，它的溶液具陰電荷（圖1－1)。組織的染色原理一般認(rèn)為基于化學(xué)結(jié)合或物理吸附作用。細(xì)胞和組織的酸性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與堿性染料親合力強(qiáng)者，稱嗜堿性（basophilia)；而堿性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)與酸性染料親合力強(qiáng)者，稱嗜酸性（acidophilia)；若與兩種染料的親合力均不強(qiáng)者，稱中性(neutrophilia)。組織的基本成分是蛋白質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是兩性電解質(zhì)。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)因氨基酸成分的不同而異，其電荷性質(zhì)又與溶液的pH值相關(guān)，根據(jù)研究目的選用合適的染色方法，調(diào)整好染液的pH值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊紅、堅(jiān)牢綠、橙黃G等，堿性染料如蘇木精、亞甲藍(lán)、堿性品紅等。組織學(xué)中最常用的是蘇木精（hematoxylin)和伊紅（eosin)染色法，簡稱HE染色法。蘇木精使細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)的嗜堿性物質(zhì)著藍(lán)紫色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的膠原纖維等著紅色。
物理吸附作用的染色方法，如用蘇丹染料顯示脂肪組織，染料溶于脂肪內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的脂滴顯色。又如用硝酸銀、氯化金等重金屬鹽顯示細(xì)胞和組織的某些結(jié)構(gòu)，則是使金屬微粒附著在結(jié)構(gòu)表面而呈棕黑色或棕黃色。銀染法中有些組織結(jié)構(gòu)可直接使硝酸銀還原而顯示，稱此為親銀性（argentaffin)；有些結(jié)構(gòu)無直接還原作用，需加入還原劑方能顯色，則稱為嗜銀性（argyrophilia)。還有些組織成分如結(jié)締組織和軟骨基質(zhì)中的糖氨多糖，當(dāng)用甲苯胺藍(lán)（toluidine blue)等堿性染料染色后呈紫紅色，這種現(xiàn)象稱為異染性(metachromasia)，其原理可能是該染料在溶液中呈單體狀態(tài)時(shí)顯藍(lán)色，當(dāng)它與多陰離子的高分子物質(zhì)耦合后，染料分子聚合成多聚體而顯紅色（圖1－2)。還有些染色方法的原理至今還不清楚。
圖1－2 異染性示意圖
(二)幾種特殊顯微鏡的應(yīng)用
1．熒光顯微鏡 熒光顯微鏡（fluorescence microscope)是用來觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡是以高壓汞燈產(chǎn)生的短波紫外線為光源，并配有激發(fā)、阻斷、吸熱和吸收紫外線等濾片系統(tǒng)，標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等)在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA含量測(cè)定。熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗)，用該標(biāo)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測(cè)該抗原的存在與分布。
2．相差顯微鏡 相差顯微鏡（phase contrast microscope)是用于觀察組織培養(yǎng)中活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的。活細(xì)胞無色透明，一般光鏡下不易分辨細(xì)胞輪廓及其結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡的特點(diǎn)是將活細(xì)胞不同厚度及細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)對(duì)光產(chǎn)生的不同折射作用，轉(zhuǎn)換為光密度差異（明暗差)，使鏡下結(jié)構(gòu)反差明顯，影像清楚。組織培養(yǎng)研究常用的是倒置相差顯微鏡（inverted phase contrast microscope)，它的光源和聚光器在載物臺(tái)的上方，物鏡在載物臺(tái)的下方，便于觀察貼附在培養(yǎng)器皿底壁上的活細(xì)胞。
3．暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡（dark-field microscope)主要用于觀察因反差或分辨力不足的微小顆粒。此種顯微鏡主要是有一個(gè)暗視野集光器，使光線不直接進(jìn)入物境，故呈暗視野。而標(biāo)本內(nèi)的小顆粒產(chǎn)生的衍射光或散射光進(jìn)入物鏡，暗視野中的顆粒呈明亮小點(diǎn)，如同在暗室可見一束光線中的微小塵粒一般。普通通光鏡最大分辨率為0.2μm，暗視野顯微鏡則可分辨0.004～0.2μm的微粒，適用于觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體運(yùn)動(dòng)及標(biāo)本中細(xì)菌等微粒的運(yùn)動(dòng)等。醫(yī)學(xué) 全在.線提供www.med126.com
4．共集激光掃描顯微鏡 共焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope,CLSM)是近10年研制成的高光敏度、高分辨率的新型儀器。它以激光為光源，光束經(jīng)聚焦后落在樣品（組織厚片或細(xì)胞)不同深度的微小一點(diǎn)，并作移動(dòng)掃描，通過電信號(hào)彩色顯像，經(jīng)過微機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行二維和三維分析處理。CLSM可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)圖像分析，細(xì)胞內(nèi)各種熒光標(biāo)記物的微量分析，細(xì)胞內(nèi)Ca2+、pH值等的動(dòng)態(tài)分析測(cè)定，細(xì)胞的受體移動(dòng)、膜電位變化、酶活性和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定，并以激光對(duì)細(xì)胞及其染色體進(jìn)行切割、分離、篩選和克隆。因此，CLSM是一種高技術(shù)產(chǎn)品，可對(duì)細(xì)胞的多種功能進(jìn)行全自動(dòng)、高效、快速的微量定性和定量測(cè)定。
其他如偏光顯微鏡用于研究組織晶體物質(zhì)及纖維等的光學(xué)性質(zhì)，紫外光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)核酸的分布與定量等。
