�。ㄈ�)補(bǔ)體參與抗原抗體反應(yīng)
這一類反應(yīng)主要包括溶血反應(yīng)（hemolytic assay)、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)（complement mediated cytotoxicuty test)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test)。
1．溶血反應(yīng) 抗體與紅細(xì)胞表面抗原相遇，形成紅細(xì)胞-抗體復(fù)合物即可使加入反應(yīng)中的補(bǔ)體活化，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，此方法可用于紅細(xì)胞的各種抗原或相應(yīng)抗體的檢測(cè)，此法比凝集反應(yīng)敏感。溶血反應(yīng)也是用于抗體分泌細(xì)胞即空斑形成細(xì)胞（PFC)檢測(cè)的原理。
2．補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)各種有核細(xì)胞與針對(duì)其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復(fù)合物能活化反應(yīng)中的補(bǔ)體，引起細(xì)胞膜穿孔，在一定時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞仍能維持一定的形態(tài)不破碎，加入水溶性染如伊紅Y（eosin Y)或臺(tái)盼藍(lán)（trypan blue)后，染料即可進(jìn)入被活化補(bǔ)體穿孔的細(xì)胞，不帶相應(yīng)抗原細(xì)胞膜保持完整的活細(xì)胞不著色。此方法可用于帶各種抗原的細(xì)胞的檢測(cè)，如進(jìn)行細(xì)胞MHC抗原的鑒定，和進(jìn)行淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞總數(shù)或其亞類的計(jì)數(shù)。在一些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中也可用這種方法，根據(jù)需要特異地消除帶某種抗原的細(xì)胞。
3．補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)當(dāng)抗原（可溶性或顆粒性)與相應(yīng)抗體結(jié)合，由于濃度低不出現(xiàn)可見反應(yīng)時(shí)，應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可檢出此抗原抗體反應(yīng)，它比凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)靈敏度高。本法包括兩個(gè)抗原抗體系統(tǒng)。一為檢測(cè)系統(tǒng)由待檢樣品與已知抗原（或抗體)組成；另一為指示系統(tǒng)，由綿羊紅細(xì)胞（SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補(bǔ)體的新鮮豚鼠血清。試驗(yàn)時(shí)試管中先加入檢測(cè)系統(tǒng)和補(bǔ)體，混合經(jīng)37℃30分鐘使抗原、抗體、補(bǔ)體形成復(fù)合物，再加入指示系統(tǒng)，如出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，說明檢測(cè)系統(tǒng)中沒有相對(duì)應(yīng)的抗原抗體，補(bǔ)體是游離的指示系統(tǒng)的SRBC和抗體結(jié)合而出現(xiàn)溶血，即為反應(yīng)陰性。如不出現(xiàn)溶血，表明檢測(cè)系統(tǒng)中有抗原抗體復(fù)合物并結(jié)合補(bǔ)體，則指示系統(tǒng)無(wú)多余的補(bǔ)體作用而沒有溶血現(xiàn)象，即為陽(yáng)性。
在敏感的抗原、抗體檢測(cè)方法（如酶標(biāo)方法)出現(xiàn)之前補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)曾廣泛用于檢測(cè)各種細(xì)菌、病毒或螺旋體（如梅毒)的抗原或抗體，由于本試驗(yàn)影響因素多，結(jié)果不穩(wěn)定現(xiàn)已被新檢測(cè)方法所代替。
四、用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原、抗體反應(yīng)
用熒光素、同位素或酶標(biāo)記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測(cè)是目前廣泛應(yīng)用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標(biāo)記物與抗原或抗體化學(xué)連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測(cè)。
1．免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence techni)是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體（或抗原)與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原（或抗體)結(jié)合，進(jìn)行定性定位檢查抗原或抗體的方法。
（1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細(xì)胞懸液，細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在，此法可用于病毒感染細(xì)胞、帶某種特異抗原的細(xì)胞（如T細(xì)胞和B細(xì)胞)或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點(diǎn)是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。
（2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細(xì)胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體（不標(biāo)記熒光)結(jié)合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標(biāo)記的第二抗體，觀察結(jié)果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的第一抗體是人或動(dòng)物的只需制備一種抗人或動(dòng)物的免疫球蛋白熒光抗體（圖20-5)。
圖20-5 免疫熒光直接法及間接法原理示意圖
免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細(xì)菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標(biāo)志，所以使用熒光標(biāo)記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。使用流式細(xì)胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞的大小、熒光強(qiáng)度。針對(duì)細(xì)胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素（FITC)發(fā)黃綠熒光，用羅丹明（TMRITC)發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標(biāo)記兩種不同的抗體，對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記染色。對(duì)淋巴細(xì)胞亞類鑒定起著巨大推動(dòng)作用。應(yīng)用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。
2．放射免疫分析法 放射免疫分析法（radioimmunoassay RIA)應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理，應(yīng)作放射性同素標(biāo)記抗原（或抗體)與相應(yīng)抗體（或抗原)結(jié)合，通過測(cè)定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，本方法可進(jìn)行超微量分析，敏感性高，可用于測(cè)定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。
放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：
�。�1)液相法：將待檢標(biāo)本（例如含胰島素抗原)與定時(shí)的同位素標(biāo)記的胰島素（抗原)和定時(shí)的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時(shí)間后，分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測(cè)定這兩部分的放射活性，計(jì)算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中，待檢標(biāo)本的胰島素抗原與同位素標(biāo)記的胰島素競(jìng)爭(zhēng)奪戰(zhàn) 性與胰島素抗體結(jié)合。非標(biāo)記的抗原越多，標(biāo)記抗原與抗體形成的復(fù)合物越少。非標(biāo)記抗原含量與標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量呈一定的函數(shù)關(guān)系。預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)記抗原作成標(biāo)準(zhǔn)曲線后，即可查出待檢標(biāo)本中胰島素的含量（圖20-6)。
圖20-6 液相放射免疫分析法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線
�。�2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標(biāo)本，最后加標(biāo)記抗體。測(cè)定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰（CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管（圖20-7)。
圖20-7 固相放射免疫分析法原理
放射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛，包括多種激素（胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素等)維生素、藥物、IgE等。
3．酶聯(lián)免疫分析法 酶聯(lián)免疫分析法（enzyme immunoassay,EIA)是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測(cè)方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗(yàn)結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測(cè)定儀作定量分析，敏感度可達(dá)ng水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、堿性磷酶（alkaline phosphatase)等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長(zhǎng)時(shí)間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測(cè)定細(xì)胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原；后者主要測(cè)定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測(cè)試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。
圖20-8 生物素－酶標(biāo)親合素系統(tǒng)反應(yīng)示意圖
�。�1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行政區(qū)�？捎瞄g接法、雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原或抗體。
