目前國內(nèi)冰凍紅細(xì)胞常規(guī)解凍去甘油的方法多為手工制備，制備過程復(fù)雜，不易操作，常常由于人為原因?qū)е录t細(xì)胞制品的質(zhì)量極不穩(wěn)定(融化后的紅細(xì)胞回收率只有60％左右)，進(jìn)而影響療效，甚至引起病人嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng)。為了及時(shí)向臨床提供Rh陰性血液，本中心于2005年4月開展了Rh陰性血液深低溫保存，利用Mll5紅細(xì)胞洗滌系統(tǒng)對凍存的Rh陰性紅細(xì)胞進(jìn)行解凍去甘油洗滌，通過1年的實(shí)踐，終于制備出各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到國家規(guī)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的解凍紅細(xì)胞，并已用于臨床，輸入效果良好。筆者對33U冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞進(jìn)行了質(zhì)量檢測，現(xiàn)將質(zhì)控及制備方法報(bào)告如下。
1 材料與醫(yī)學(xué)全在線方法
1．1 儀器設(shè)備
CA 620全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(瑞士MEDONIK)，722型分光光皮儀(上海第三儀器制造廠)，CR7離心機(jī)(日本HITACHI)，-80℃專用冰箱(美國)，無菌接口機(jī)(日本TERUMO)，M115洗滌系統(tǒng)(美國)。
1．2 方法
制備冰凍紅細(xì)胞采用慢速冷凍法，用4℃保存6天內(nèi)的Rh陰性全血或懸浮紅細(xì)胞離心除去血漿的紅細(xì)胞中加入57.1％(g／v)甘油為主要成分的紅細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，待紅細(xì)胞甘油化后于-80℃專用冰箱冷凍保存，7天～350天后于39℃水浴解凍，參考美固FDA推薦方法并適當(dāng)改進(jìn)：第一次稀釋：向血袋內(nèi)注入9％NaCI溶液50ml，平衡2min；第二次稀釋：向血袋注入0．9％ NaCl 溶液100 ml，平衡2min；第三次稀釋：向血袋注入0．9％NaCl溶液150 ml，平衡2min。然后，用M115型紅細(xì)胞洗滌系統(tǒng)洗滌：注入0．9％NaC1溶液連續(xù)洗滌，當(dāng)洗滌液顏色與制造商所提供的比色卡上“2”相當(dāng)時(shí)洗滌完成。洗滌后用0．9％NaCl溶液懸浮紅細(xì)胞。
1．3 質(zhì)量檢測
用血細(xì)胞分析儀檢測紅細(xì)胞、血紅蛋白含量及洗滌前白細(xì)胞、血小板；Nageotte板檢測洗滌后的白細(xì)胞數(shù)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測洗滌后血小板；鄰甲聯(lián)苯胺法檢測冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞上清液游離血紅蛋白含量及體外溶血試驗(yàn)；采用磷酸甘油氧化酶 - 過氧化物酶(GPO—POD)法測定殘余甘油含量。
2 結(jié)果
2．1 33袋冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞在光鏡下觀察細(xì)胞膜完整，表面呈現(xiàn)雙凹狀，無團(tuán)聚現(xiàn)象。
2．2 紅細(xì)胞回收率(％)80．24±6．19，甘油含量(g/L)3．79±0．88，游離血紅蛋白(g/L)0．71±0．23，解凍紅細(xì)胞體外溶血(％)21．66±11．2，見表1。
表1 33U冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞的質(zhì)控結(jié)果
| 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) | ||
| 洗滌前Hb（g/L) | 119±10.5 | |
| 洗滌后Hb（g/L) | 110±9.7 | |
| 紅細(xì)胞回收率（%) | 80.24±6.19 | ≥80% |
| 殘余甘油含量（g/L) | 3.79±0.88 | ≤10g/L |
| 游離Hb（g/L) | 0.71±0.23 | ≤1g/L |
| 體外溶血（%) | 21.66±11.2 | ≤50% |
| 殘余白細(xì)胞（%) | 0.9 | ≤1% |
| 殘余血小板（%) | 0.5 | ≤1% |
3 討論
Rh陰性血型在漢族人群中僅占2‰ 一5％，而血液常規(guī)保存有效期只有21—35天，因此，采集到的血液常因臨床無需要而造成浪費(fèi)，另一方面，臨床緊急需要時(shí)，也可能因庫存不足或偏型而造成供血困難，甚至延誤臨床急癥搶救時(shí)間。所以，Rh陰性血液的深低溫長期保存，對于血源、血液采集和供血的及時(shí)合理調(diào)配尤為重要。
根據(jù)質(zhì)控結(jié)果，這些數(shù)據(jù)表明，利用Mll5紅細(xì)胞洗滌系統(tǒng)，洗滌冰凍紅細(xì)胞的方法是可行的，但需進(jìn)一步改進(jìn)以最大程度地減少紅細(xì)胞的丟失。
影響紅細(xì)胞回收率的原因分析：
紅細(xì)胞甘油化是整個(gè)冷凍實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。細(xì)胞對滲透壓改變十分敏感，為使細(xì)胞承受能力在滲透壓變化范圍之內(nèi)，就一定要掌握好甘油的注入速度。細(xì)胞充分甘油化后需要平衡一段時(shí)間，但時(shí)間延長會(huì)增加溶血，建議甘油化細(xì)胞平衡30分鐘內(nèi)凍存。與52667788.cn冰凍紅細(xì)胞融化解凍的方法有關(guān)。我們認(rèn)為融化冰凍紅細(xì)胞的溫度時(shí)間是關(guān)鍵，融化時(shí)水溫過低，可再度形成冰晶，將會(huì)刺破紅細(xì)胞膜而溶血，融化時(shí)水溫過高時(shí)間過長可使紅細(xì)胞膜的表面張力過度增高、破裂而溶血，我們認(rèn)為融化冰凍紅細(xì)胞的溫度控制在39℃，時(shí)間不超過20分鐘。與洗滌去甘油前加高滲鹽的濃度有關(guān)。由于冰凍紅細(xì)胞在融化后，紅細(xì)胞處于高滲狀態(tài)，所以必須先加入9％氯化鈉溶液，使紅細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓達(dá)到平衡，再分兩次加入0．9％氯化鈉溶液，使紅細(xì)胞膜內(nèi)的滲透壓由高滲呈梯度逐漸過渡到等滲后，再進(jìn)行循環(huán)洗滌去甘油。通過實(shí)驗(yàn)說明該技術(shù)已完成Rh陰性稀有血液的保存以及解凍，并基本解決了本地區(qū)Rh陰性血液需求緊張的狀況。
