實(shí)驗(yàn)二十三? 血清γ-球蛋白的分離、純化與鑒定
（綜合性實(shí)驗(yàn))
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
本實(shí)驗(yàn)采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法以分離、純化和鑒定血清中的γ-球蛋白，達(dá)到訓(xùn)練綜合運(yùn)用及掌握電泳、離心、層析等基本的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的目的。
【實(shí)驗(yàn)原理】
血清中含有多種蛋白質(zhì)。不同種類的蛋白質(zhì)其分子量、溶解度以及在一定條件下帶電荷的情況不同，可根據(jù)這些性質(zhì)的差別，分離及提純蛋白質(zhì)。
1. 利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽中的溶解度的差異，采用鹽析法進(jìn)行分離。半飽和硫酸銨可使球蛋白沉淀析出，而清蛋白仍溶解在溶液中，經(jīng)過離心，沉淀部分即為含γ-球蛋白的粗制品。
2. 鹽析得到的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化，因此須除去。采用凝膠層析法，利用蛋白質(zhì)與無機(jī)鹽之間的分子量差異，達(dá)到去鹽的目的。
3. 純化的γ-球蛋白利用醋酸纖維薄膜電泳鑒定其純度。
【操作步驟】
1. 分段鹽析：
⑴ 取血清1.0 mL加入離心管中，加磷酸鹽緩沖液（PBS)1.0 mL，混勻。再逐滴加入pH 7.2飽和硫酸銨液2.0 mL，邊加邊搖勻。靜置20分鐘后離心（3000 rpm×10分鐘)，傾去上清液（此液中主要含清蛋白)并盡量倒凈，沉淀為球蛋白。
⑵ 將上述離心管中的沉淀用1.0 mLPBS攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨液0.5 mL，混勻，靜置20分鐘后離心（3000 rpm×10醫(yī)學(xué)全.在線分鐘)，傾去上清液（此液中主要含α、β-球蛋白)并盡量倒凈，其沉淀為初52667788.cn/kuaiji/步純化的γ-球蛋白。如要獲得更純的γ-球蛋白，可重復(fù)此過程1次，最后用1.0mL PBS將沉淀溶解。
2. 脫鹽：
⑴ 裝柱：取層析柱，關(guān)緊下端出口，加蒸餾水少許，緩慢加入葡聚糖凝膠G-25懸液，待底部沉積1 cm厚的凝膠后，打開下端出口，繼續(xù)加入凝膠至凝膠沉積15 cm高，并注意保持凝膠床表面平整，然后經(jīng)PBS流洗平衡。
⑵ 上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端出口開關(guān)，使柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床表面，關(guān)緊下端出口。用滴管吸取γ-球蛋白液，小心緩慢地沿層析柱內(nèi)壁加到凝膠床表面上，注意不要破壞凝膠床表面的平整。打開下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床，小心加入少許PBS于柱內(nèi)，待進(jìn)入凝膠床后再加入少許的PBS，如此重復(fù)三次，以洗凈柱內(nèi)壁上的樣品溶液，然后可加入多量的PBS進(jìn)行洗脫，流速為5滴/分。
⑶ 收集：事先應(yīng)準(zhǔn)備好10支試管，于加樣開始后立即收集洗脫液。每收集約1.0 mL換一管。
⑷ 檢查：取瓷比色盤2個（一個為黑色背景，另一個為白色背景)，按洗脫液的管號順序分別取1滴滴于比色盤中，前者各加10%三氯乙酸5滴；后者各加納氏試劑1滴。將檢查結(jié)果用“-，+，+”等符號記錄于表中。選取蛋白含量高且不含銨離子的樣品液進(jìn)行純度鑒定。
3. 純度鑒定：
⑴ 取于巴比妥緩沖液中充分浸濕醋酸纖維素薄膜1張，用濾紙吸去多余的水分，于無光澤面點(diǎn)樣。
⑵ 在距膜條一端約2cm處，用X光軟片蘸取全血清和純化的γ-球蛋白樣品液（第3管)分別點(diǎn)于膜條上。
⑶ 將巴比妥緩沖液加于電泳槽內(nèi)，再將點(diǎn)樣后的膜條放置于電泳槽槽架上。放置時膜條的無光澤面應(yīng)向下，點(diǎn)樣端置于陰極，膜條與濾紙需貼緊。
⑷ 接通電源，以150V恒壓電泳約45分鐘。
⑸ 通電完畢后，用鑷子將膜條取出，浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染色1分鐘取出，立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直到背景漂凈為止。用濾紙吸干膜條，比較純化前與純化后電泳圖譜的變化，以確定樣品的純度。
【結(jié)果和計(jì)算】
1. 凝膠柱分離流洗結(jié)果：
| 管號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 蛋白沉淀 | - | + | ++ | - | - | - | - | - | - | - |
| 銨離子 | - | - | - | - | - | + | ++ | ++ | ++ | + |
2. 電泳鑒定結(jié)果：
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純化前血清蛋白的醋纖膜電泳
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純化后血清蛋白的醋纖膜電泳
【結(jié)論和討論】
1. 電泳鑒定結(jié)果顯示，血清蛋白樣品經(jīng)分段鹽析、凝膠層析等技術(shù)方法分離純化后得到了較純的γ-球蛋白。因此，采用上述實(shí)驗(yàn)方法能夠從血清中純化γ-球蛋白。
2. 第3支試管中的收集液為蛋白含量最高且不含銨離子的樣品液，因此通過凝膠層析能有效去除樣品中的鹽離子成分。
