實(shí)驗(yàn)三 結(jié)果觀察、膿檢（1)、突變、儀器 結(jié)果觀察 細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況
在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況 大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖后呈現(xiàn)均勻混濁狀態(tài)；少數(shù)鏈狀的細(xì)菌則呈沉淀生長(zhǎng)；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌等專性需氧菌呈表面生長(zhǎng)，常形成菌膜。
在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況 將標(biāo)本或培養(yǎng)物劃線接種在固體培養(yǎng)基的表面，因劃線的分散作用，使許多原混雜的細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面上散開，稱為分離培養(yǎng)。一般經(jīng)過18～24 h培養(yǎng)后，單個(gè)細(xì)菌分裂繁殖成一堆肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落。挑取一個(gè)菌落，移種到另一培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)出來的細(xì)菌均為純種，稱為純培養(yǎng)。這是從臨床標(biāo)本中檢查鑒定細(xì)菌很重要的第一步。各種細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上形成的菌落，在大小、形狀、顏色、氣味、透明度、表面光滑或粗糙、濕潤(rùn)或干燥、邊緣整齊與否，以及在血瓊脂平板上的溶血情況等均有不同表現(xiàn)，這些有助于識(shí)別和鑒定細(xì)菌。 瓊脂平板上，可計(jì)數(shù)菌落，推算標(biāo)本中的活菌數(shù)。這種菌落計(jì)數(shù)法常用于檢測(cè)自來水、飲料、污水和臨床標(biāo)本的活菌含量。 膿汁標(biāo)本的分離 化膿性標(biāo)本的檢驗(yàn)是一個(gè)連續(xù)的實(shí)驗(yàn)。很多細(xì)菌感染都可以引起化膿，膿拭子分離培養(yǎng)、鑒定，到藥物敏感試驗(yàn)，是一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)。今天先做： 1. 取標(biāo)本。無菌操作，取引起病灶的目的菌，而不是污染菌。觀察病灶，膿稀薄還是粘稠，又沒有新鮮血液混入，顏色、氣味如何，作為第一手資料。 2. 做涂片，革蘭染色。染色結(jié)果與病灶性狀相結(jié)合，判斷出菌的大致范圍，分離培養(yǎng)選擇合適的培養(yǎng)基和方法。 3. 膿拭子在血平板上進(jìn)行劃線分離。 突變 Ames試驗(yàn)利用細(xì)菌突變的原理，使用一組突變菌株，通過檢測(cè)突變株回復(fù)突變率的高低檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)是否具有致突變性，致突變性與致癌性高度相關(guān)。菌株：鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型，不添加外援組氨酸則不可生長(zhǎng)。待檢化學(xué)物質(zhì)溶液浸泡濾紙片，貼到含有微量組氨酸的培養(yǎng)基上，紙片周圍形成組氨酸的濃度梯度。組氨酸濃度限量，只可支持菌的幾次分裂，無法形成肉眼可見菌落，只有發(fā)生組氨酸回復(fù)突變的菌才可在平板上形成菌落�；瘜W(xué)物質(zhì)若能引起突變，則有可能使缺陷型回復(fù)，紙片周圍會(huì)出現(xiàn)比其他位置密集的肉眼可見的單菌落。根據(jù)菌落多少進(jìn)行致突變性篩選。此法檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)多，所用時(shí)間少，是世界通用的致癌物檢測(cè)的第一梯隊(duì)實(shí)驗(yàn)。 滅菌儀器 熱力滅菌法分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類，在同一溫度下，后者的效力比前者大。這是因?yàn)椋孩贊駸嶂屑?xì)菌菌體蛋白較易凝固；②濕熱的穿透力比干熱大；③濕熱的蒸氣有潛熱存在。水由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)放出的潛熱，可迅速提高被滅菌物體的溫度。
1. 干熱滅菌法 干熱的殺菌作用是通過脫水干燥和大分子變性。一般細(xì)菌繁殖體在干燥狀態(tài)下， 80～100℃經(jīng)h可被殺死；芽胞則需160～170℃經(jīng)2h才死亡。
a. 焚燒 直接點(diǎn)燃或在焚燒爐內(nèi)焚燒。是一種徹底的滅菌方法，但僅適用于廢棄物品或動(dòng)物尸體等。
b. 燒灼 直接用火焰滅菌，適用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的接種環(huán)、試管口等的滅菌。
c. 干烤 利用干烤箱滅菌，一般加熱至160～170℃經(jīng)2 h。適用于高溫下不變質(zhì)、不損壞、不蒸發(fā)的物品，例如玻璃器皿、瓷器、玻質(zhì)注射器等的滅菌。
2. 高壓蒸氣滅菌法（濕熱) 是一種最有效的滅菌方法。滅菌的溫度取決于蒸氣的壓力。在一個(gè)大氣壓下，蒸氣的溫度是100℃。如果蒸氣被限制在密閉的容器中，隨著壓力升高，蒸氣的溫度也相應(yīng)升高。在103.4kPa(1.05kg/cm2)蒸氣壓下，溫度達(dá)到121.3℃，維持15～20min，可殺滅包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。高壓蒸汽滅菌器（autoclave)就是根據(jù)這一原理制成的，常用于一般培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)敷料等耐高溫、耐濕物品的滅菌。 5 ※<實(shí)驗(yàn)四>
實(shí)驗(yàn)四 膿檢（2)、菌落、血漿凝固酶、藥敏試驗(yàn) 上次的實(shí)驗(yàn)我們做了革蘭染色和平板接種劃線分離。菌落是細(xì)菌分類的鑒定指標(biāo)，不同菌有不同特點(diǎn)，上次已經(jīng)講過，這次仍然要用這些指標(biāo)分析你分離到的單菌落。大�。ù缶�、小菌落、中等菌落)、形狀（圓形、不規(guī)則形)、顏色、氣味、透明度（不透明、半透明、透明)、表面光滑或粗糙、濕潤(rùn)或干燥、凹凸情況、邊緣整齊與否，有沒有色素產(chǎn)生（脂溶性、水溶性)、以及在血瓊脂平板上的溶血情況（α－環(huán)、β－環(huán)、γ－環(huán))。 在血瓊脂平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖后，溶血現(xiàn)象分為3類：
① α－環(huán)：菌落周圍有1~2mm寬的草綠色溶血環(huán)，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞并未完全溶解。 �、� β－環(huán)：：菌落周圍形成一個(gè)2~4mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環(huán)。溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解。 ③ γ－環(huán)：菌落周圍無溶血環(huán)。 引起化膿性感染的球菌，都是G＋球菌，主要有5種。 a. 葡萄球菌 形成圓形、隆起、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、不透明的菌落。直徑在2mm左右。致病性葡萄球菌常產(chǎn)金黃色脂溶性色素和形成β－溶血環(huán)。 b. 鏈球菌 形成圓形、灰白色、表面光滑、邊緣整齊、直徑0.5~0.75mm的細(xì)小菌落。甲鏈，致病力弱，α－溶血環(huán)；乙鏈，致病力強(qiáng)，β－溶血環(huán)；丙鏈，一般無致病性，γ－溶血環(huán)。 c. 肺炎球菌 形成細(xì)小、灰白色、圓形略扁、半透明，有草綠色α－溶血環(huán)。與甲型溶血性鏈球菌很相似。 根據(jù)菌落形態(tài)和兩次革蘭染色結(jié)果可以初步確定為何菌。 致病性葡萄球菌的鑒定主要根據(jù)產(chǎn)生凝固酶和耐熱核酸酶試驗(yàn)。陽性具有致病性。最常用血漿凝固酶試驗(yàn)。 凝固酶是能使人或兔血漿發(fā)生凝固的酶類物質(zhì)。致病株大多數(shù)能產(chǎn)生，故凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。
a. 試管法：測(cè)定游離凝固酶，被人或兔血漿中的協(xié)同因子激活為凝血酶樣物質(zhì)后，使液態(tài)的纖維蛋白原變成固態(tài)的纖維蛋白，從而血漿凝固。兔血漿1：4稀釋，加入葡萄球菌，1～4小時(shí)后，是否凝固判斷陽性，陰性。準(zhǔn)確，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。 b. 玻片法：測(cè)定結(jié)合凝固酶。實(shí)質(zhì)是在該菌株的表面有纖維蛋白原受體，當(dāng)菌混懸于人或兔血漿時(shí)，纖維蛋白原與菌受體交聯(lián)而使細(xì)菌凝聚。玻片兩端各滴一滴生理鹽水，用接種環(huán)取分離到的葡萄球菌在兩側(cè)的生理鹽水中研磨成混懸液。試驗(yàn)側(cè)加一滴1：4兔血漿，對(duì)照側(cè)加一滴生理鹽水�；蝿�(dòng)玻片觀察現(xiàn)象，如果對(duì)照組不凝而試驗(yàn)組出現(xiàn)顆粒狀凝集則說明結(jié)果為陽性；如果兩側(cè)都不凝為陰性；兩次都凝則結(jié)果無意義。 甲鏈和肺炎球菌菌落外觀很像，需要用試驗(yàn)區(qū)分，以膽汁溶菌試驗(yàn)、菊糖發(fā)酵和奧普托辛試驗(yàn)最為常用。必要時(shí)可作小鼠毒力試驗(yàn)加以鑒別。在上述試驗(yàn)中，肺炎鏈球菌均應(yīng)陽性，而甲型溶血性鏈球菌為陰性。 a. 膽汁溶菌試驗(yàn) 肺炎球菌有自溶酶，膽汁激活作用下細(xì)菌崩解。加膽汁或10%去氧膽酸鈉至菌液，置室溫或37℃，在5~10min出現(xiàn)細(xì)菌溶解、培養(yǎng)液變清者為肺炎鏈球菌。甲型溶血性鏈球菌的膽汁溶菌試驗(yàn)為陰性。 b. 菊糖發(fā)酵試驗(yàn) 分別接種菊糖發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，肺炎球菌分解菊糖產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由紫色變黃色，甲鏈培養(yǎng)基不變色。 c. Optochin敏感試驗(yàn) 方法似藥敏。將待試菌涂布于血瓊脂平板表面；取直徑6mm無菌濾紙圓片在1:2000 optochin溶液中浸濕，置于平板涂菌處。37℃ 48h后觀察抑菌圈大小，肺炎鏈球菌的抑制圈直徑常在20mm以上，甲型溶血性鏈球菌（約98%)小于12mm。 根據(jù)膿汁兩次革蘭染色結(jié)果和鑒定試驗(yàn)，一般可判定為何種菌致病，診斷后進(jìn)行治療。鏈球菌耐藥菌株少，鑒定后直接根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選藥物即可；葡萄球菌要做標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏試驗(yàn)，常用紙片法，選擇效價(jià)高又便宜的藥。 藥敏試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏紙片，紙片上藥物定量，不同藥含量不同，給出抑菌環(huán)直徑大小與藥物敏感性的參考值。標(biāo)準(zhǔn)M-H培養(yǎng)基定量每個(gè)平板，控制厚度，。液體過夜培養(yǎng)后菌濃調(diào)整到一定范圍，棉簽蘸取涂滿平板，不少于三個(gè)方向涂布涂滿涂均勻。貼上藥敏紙片，每?jī)蓚�(gè)藥敏紙片間隔20mm，距邊緣10mm。藥敏紙片周圍形成濃度梯度，由藥敏紙片向周圍濃度逐漸降低。藥物效果越好，抑菌環(huán)直徑越大；效果越差，抑菌環(huán)直徑越小。 5 ※<實(shí)驗(yàn)五>
實(shí)驗(yàn)五 藥敏結(jié)果、腸菌特性、生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng) 上次的平板經(jīng)過16~18溫育培養(yǎng)，大家把自己的藥敏結(jié)果找到，量量抑菌環(huán)直徑大小，與標(biāo)準(zhǔn)值比較，找出其敏感藥物。綜合三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，從分離鑒定到生化反應(yīng)、藥敏試驗(yàn)，完整的系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 今天是腸道致病菌的檢查。 取標(biāo)本一般取糞便，有些病號(hào)取其他樣本，中段尿、血液、膿液、腦脊液等。傷寒初期要取血，尿液和糞便2周以后才可以檢出，也可取小皮疹。 取糞便直接分離培養(yǎng)，取血液、骨髓接種肉湯增菌。尿液離心后取渣再分離培養(yǎng)。標(biāo)本接種于腸道鑒別或選擇培養(yǎng)基（SS培養(yǎng)基、伊紅－美藍(lán)培養(yǎng)基或中國(guó)藍(lán)培養(yǎng)基)上，37℃孵育18-24小時(shí)。挑取無色半透明可疑菌落，進(jìn)行初步鑒定，接種雙糖培養(yǎng)基。 雙糖培養(yǎng)基 下層含葡萄糖的半固體，上層含乳糖的固體，加上酸性復(fù)紅做指示劑。先穿刺接種再表面劃線，觀察動(dòng)力，葡萄糖、乳糖利用能力，是否產(chǎn)氣。（顏色變紅則可以利用糖，上下層之間出現(xiàn)氣柱則發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣，下層有擴(kuò)散生長(zhǎng)則有動(dòng)力。) 單糖發(fā)酵管 液體培養(yǎng)基中只含有一種糖，溴甲酚紫作指示劑，大試管內(nèi)倒置小試管。接種后培養(yǎng)，可以利用糖的產(chǎn)酸，培養(yǎng)基顏色由紫色變黃色，若產(chǎn)氣小試管頂部推出一端氣柱。觀察產(chǎn)氣比雙糖培養(yǎng)基敏感的多。至少做五種糖：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇。 VP試驗(yàn) 大腸埃希菌和產(chǎn)氣桿菌均能發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，兩者不能區(qū)別。但產(chǎn)氣桿菌能使丙酮酸脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在堿性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙酰與含胍基化合物反應(yīng)生成紅色化合物，是為VP試驗(yàn)陽性。大腸埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，故VP試驗(yàn)陰性，
甲基紅試驗(yàn) 產(chǎn)氣桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者經(jīng)脫羧后生成中性的乙酰甲基甲醇，故培養(yǎng)液pH>5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，是為甲基紅試驗(yàn)陰性。大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，培養(yǎng)液pH ≤4.5，甲基紅指示劑呈紅色，則為甲基紅試驗(yàn)陽性。
枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 當(dāng)某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣桿菌)利用銨鹽作為唯一氮源，并利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源時(shí)，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，并分解銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，是為該試驗(yàn)陽性。大腸埃希菌不能利用枸櫞酸鹽為唯一碳源，故在該培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，是為枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性。
吲哚試驗(yàn) 有些細(xì)菌如大腸埃希菌、變形桿菌、霍亂弧菌等能分解培養(yǎng)基中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì))，經(jīng)與試劑中的對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色，是為吲哚試驗(yàn)陽性。
尿素酶試驗(yàn) 變形桿菌有尿素酶，能分解培養(yǎng)基中的尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基變堿，以酚紅為指示劑檢測(cè)為紅色，是為尿素酶試驗(yàn)陽性。
細(xì)菌的生化反應(yīng)用于鑒別細(xì)菌，尤其對(duì)形態(tài)、革蘭染色反應(yīng)和培養(yǎng)特性相同或相似的細(xì)菌更為重要。吲哚（I)、甲基紅（M)、VP（V)、枸櫞酸鹽利用（C)四種試驗(yàn)常用于鑒定腸道桿菌，合稱為IMViC試驗(yàn)。例如大腸埃希菌對(duì)這四種試驗(yàn)的結(jié)果是“――＋＋”，產(chǎn)氣桿菌則為“――＋＋”。 血清學(xué)試驗(yàn) 若初步鑒定為沙門氏菌，則可用沙門氏A-F群多價(jià)血清進(jìn)行凝集反應(yīng)確證。發(fā)生凝集，則是沙門氏菌。不發(fā)生凝集，60℃加熱30min后破壞掉Vi抗原再次做沙門氏A-F群多價(jià)血清凝集反應(yīng)，發(fā)生凝集是沙門氏菌；不發(fā)生凝集則是沙門氏菌A-F以外的菌；若凝集，則可以用特異性血清進(jìn)行分型。 5 ※<實(shí)驗(yàn)六>
實(shí)驗(yàn)六 肥達(dá)反應(yīng)、炭疽、肉毒、白喉形態(tài)、菌落 肥達(dá)反應(yīng)是診斷傷寒、副傷寒的反應(yīng)。反應(yīng)要進(jìn)行一段時(shí)間才能看結(jié)果，所以我們先講怎么做，做上再接著講原理。 1. 取試管作標(biāo)記，每排7支，共4排。 2. 加生理鹽水0.5ml/管。 3. 加血清作系列稀釋，各排第一管加1:10的待檢血清0.5ml，倍比稀釋至第6管，第7管作對(duì)照。 4. 加抗原，每排加一種已知抗原菌液0.5ml/管，混勻，放50℃水浴1h，觀察結(jié)果。 5. 室溫過夜，觀察結(jié)果。 抗原菌液四排：TH（傷寒桿菌鞭毛型)、TO（傷寒桿菌菌體型)、AH（甲型副傷寒桿菌鞭毛型)、BH（乙型副傷寒桿菌鞭毛型)。 觀察結(jié)果，鞭毛抗原形成絮狀疏松沉淀，浮擱在管底，輕輕振動(dòng)就可以浮起，易散開。菌體抗原結(jié)合時(shí)間長(zhǎng)，顆粒狀凝集緊貼管底，輕搖試管不易散開。計(jì)算出現(xiàn)明顯凝集的試管的最高稀釋度即為效價(jià)，進(jìn)行結(jié)果分析。 肥達(dá)試驗(yàn)是用已知傷寒沙門菌菌體（O)抗原和鞭毛（H)抗原，以及引起副傷寒的甲型副傷寒、肖氏沙門菌希氏沙門菌H抗原的診斷菌液與受檢血清作試管或微孔板凝集試驗(yàn)，測(cè)定受檢血清中有無相應(yīng)抗體及其效價(jià)的試驗(yàn)。
肥達(dá)試驗(yàn)結(jié)果的解釋必須結(jié)合臨床表現(xiàn)、病程、病史，以及地區(qū)流行病學(xué)情況。
1. 正常值 人們因沙門菌隱性感染或預(yù)防接種，血清中可含有一定量的有關(guān)抗體，且其效價(jià)隨地區(qū)而有差異。一般是傷寒沙門菌O凝集效價(jià)≥1：80，H凝集效價(jià)≥1：160，引起副傷寒的沙門菌H凝集效價(jià)≥1：80時(shí)才有診斷價(jià)值。
2. 動(dòng)態(tài)觀察 有時(shí)單次效價(jià)增高不能定論，可在病程中逐周復(fù)查。若效價(jià)逐次遞增或恢復(fù)期效價(jià)比初次≥4倍者始有意義。
3. O與H抗體的診斷意義 患傷寒或副傷寒后，O與H在體內(nèi)的消長(zhǎng)情況不同。IgM類O抗體出現(xiàn)較早，持續(xù)約半年，消退后不易受非傷寒沙門菌等病原體的非特異刺激而重現(xiàn)。IgG類H抗體則出現(xiàn)較晚，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，消失后易受非特異性病原刺激而能短暫地重新出現(xiàn)。因此，O、H凝集效價(jià)均超過正常值，則腸熱癥的可能性大；如兩者均低，患病可能性��；若O不高H高，有可能是預(yù)防接種或非特異性回憶反應(yīng)；如O高H不高，則可能是感染早期或與傷寒沙門菌O抗原有交叉反應(yīng)的其他沙門菌（如腸炎沙門菌)感染。
4. 其他 有少數(shù)病例，在整個(gè)病程中，肥達(dá)試驗(yàn)始終在正常范圍內(nèi)。其原因可能由于早期使用抗生素治療，或患者免疫功能低下等所致。
炭疽芽孢桿菌 革蘭陽性，兩端平截、粗大，鏈狀竹節(jié)樣排列，芽胞在有氧條件下形成，呈橢圓形，位于菌體中央，對(duì)鑒別有意義。菌落灰白色，粗糙，大，邊緣不整齊，在低倍鏡下觀察邊緣呈卷發(fā)狀。 肉毒梭菌 革蘭陽性，粗短桿菌，次端生芽胞呈橢圓形,粗于菌體,位于次極端,使細(xì)胞呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀。 白喉棒狀桿菌 菌體細(xì)長(zhǎng)微彎，一端或兩端膨大呈棒狀。細(xì)菌常排列呈V、L等文字形。革蘭染色陽性。用美藍(lán)短時(shí)間染色菌體著色不均勻，出現(xiàn)有深染的顆粒，稱為異染顆粒。顆粒的主要成分是核糖核酸和多磷酸鹽，在鑒定時(shí)有重要意義。 5 ※<實(shí)驗(yàn)七>
實(shí)驗(yàn)七 分枝菌培養(yǎng)抗酸染色、雞胚接種其他微生物 齊－尼抗酸染色 制片和革蘭染色一樣，接種環(huán)沾卡介苗在玻片上劃直徑1cm左右的圓。 1. 制片：取牙垢→涂膜→自然干燥→火焰固定 2. 石炭酸復(fù)紅加熱蒸染5分，去濾紙片，水洗→3％鹽酸酒精脫色1～2分，水洗→美藍(lán)復(fù)染30秒～1分，水洗→吸干、鏡檢 注意：a. 加熱蒸染，涂片以后，蓋上濾紙片在涂膜部位，用夾子夾好，加上染液石炭酸復(fù)紅，酒精燈上加熱蒸染5分鐘。加熱過程中不要蒸干了，要補(bǔ)加染液，不要太燙時(shí)加，玻片會(huì)裂�？刂坪镁嚯x酒精燈火焰高度，及時(shí)添加染液。 b. 脫色時(shí)間根據(jù)片子厚薄而定，看著沒有濃重紅色冒出即可。 結(jié)果：結(jié)核、麻風(fēng)桿菌類抗酸菌可以抵抗3％鹽酸酒精脫色，不能脫去紅色，美藍(lán)復(fù)染后仍為紅色，稱抗酸染色陽性。其他菌和物質(zhì)脫色時(shí)脫成無色再用美藍(lán)復(fù)染成藍(lán)色，抗酸染色陰性。 懷疑是肺結(jié)核的可以直接做痰涂片�？顾崛旧奶低科�，粘液成分和其他菌蛋白是藍(lán)色，只有結(jié)核桿菌是紅色。若看到藍(lán)色背景上的紅色細(xì)長(zhǎng)桿菌，則多是結(jié)核桿菌。為了提高陽性檢出率，可以先用3%鹽酸、6%硫酸或4%NaOH 處理15min，降解粘性成分。 培養(yǎng)要把培養(yǎng)基pH調(diào)低，最適pH6.5-6.8，培養(yǎng)基要求營(yíng)養(yǎng)豐富，一般常用羅氏培養(yǎng)基，含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機(jī)鹽和孔雀綠等。用大粗試管玻璃紙包扎緊了進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)緩慢，18小時(shí)分裂一次，2-4周可長(zhǎng)出干燥顆粒狀菌落，呈菜花狀或饅頭渣狀，表面粗糙，邊緣不整齊，不透明。 雞胚接種 病毒分離早期的常用方法，我國(guó)湯飛凡最早用雞胚接種衣原體。 雞受精卵經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后會(huì)形成雞胚。羊膜腔、卵黃囊、尿囊、絨毛尿囊膜都可以接種，不同病毒選用部位不同。 本次試驗(yàn)選用新城疫雞瘟病毒，進(jìn)行尿囊接種。檢卵器檢卵，標(biāo)出氣室（透光度強(qiáng)亮度大的部位)，雞胚（最暗的部位)。雞胚放蛋托上，碘酒在氣室消毒，酒精脫碘，錐子燒灼后在氣室中間或邊緣打孔，無菌注射器取病毒液0.1～0.2ml，垂直進(jìn)針，穿過氣室后注入。蠟油封上孔。下次用這次結(jié)果，注意無菌操作。 病毒培養(yǎng)常用三種方法 1. 細(xì)胞培養(yǎng) 目前最常用的方法是細(xì)胞培養(yǎng)，選擇適當(dāng)?shù)脑囵B(yǎng)細(xì)胞(敏感性高)及傳代細(xì)胞系(便于在實(shí)驗(yàn)室保存)作病毒分離培養(yǎng)。接種標(biāo)本后，細(xì)胞可出現(xiàn)病變或也可并不出現(xiàn)病變而需用血細(xì)胞吸附等方法檢測(cè)是否有病毒增殖，并進(jìn)一步還需用特殊的抗體鑒定病毒的種類。 2. 雞胚接種 在流感病毒的分離培養(yǎng)中，最敏感而特異的方法是雞胚接種，并用血凝和血凝抑制試驗(yàn)以鑒定病毒。此外，細(xì)胞培養(yǎng)也可應(yīng)用。分離流感病毒在發(fā)現(xiàn)新變異株中具有重要價(jià)值。 3. 動(dòng)物試驗(yàn) 接種動(dòng)物分離病毒的方法目前已很少應(yīng)用，但對(duì)狂犬病病毒及乙型腦炎病毒的分離與鑒定中還需應(yīng)用動(dòng)物接種，并結(jié)合用特異抗體作中和試驗(yàn)或作免疫熒光染色以鑒定病毒種類。 觀察標(biāo)本 白色念珠菌 真菌，大、紫色、球菌 鉤端螺旋體 銀染，黃色背景下深棕黑色細(xì)線狀，一端或兩端有鉤 結(jié)核桿菌痰涂片 紅色細(xì)長(zhǎng)桿菌 5 ※<實(shí)驗(yàn)八> 實(shí)驗(yàn)八 雞胚收剖、血凝、鼠腦接種、真菌培養(yǎng) 雞胚收剖 上次做了雞胚接種，這次做雞胚收剖。把雞胚放蛋托上，先消毒蛋殼氣室處，用剪子或鑷子敲開個(gè)口，剪掉氣室，揭去第一層卵膜，剪開絨毛尿囊膜，用吸管收集尿囊液。 血凝試驗(yàn) 某些病毒具有血凝素，可以使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞凝集，可以通過血凝試驗(yàn)確定有無具有血凝素的病毒存在，其效價(jià)高低。 1. 血凝板上第1個(gè)孔加0.4ml生理鹽水，其余9孔加0.25ml生理鹽水。 2. 收剖雞胚取尿囊液0.1ml加入第1孔，倍比稀釋至第9孔，第10孔作對(duì)照。 3. 加1％新鮮雞血球液，每孔0.25ml，混勻后，室溫靜置1h觀察結(jié)果。 結(jié)果判定 第10孔對(duì)照血球自然沉降到孔底，成光滑圓點(diǎn)狀，整個(gè)系統(tǒng)可用。以對(duì)照孔依次向前看，根據(jù)凝集現(xiàn)象記錄結(jié)果。血凝效價(jià)以最先出現(xiàn)的＋＋為準(zhǔn)。計(jì)算效價(jià)出現(xiàn)的稀釋度。 血凝試驗(yàn)只能檢查是否有具有血凝素的病毒存在，要確定是哪一種病毒，還要做血凝抑制試驗(yàn)。 血凝抑制試驗(yàn) 樣本液先加入特異性抗體作用一段時(shí)間，如果是相應(yīng)的抗原抗體結(jié)合則封閉住血凝素位點(diǎn)，加入血球有血凝抑制現(xiàn)象。對(duì)照組設(shè)三組：病毒對(duì)照，抗體對(duì)照，緩沖液對(duì)照。三個(gè)對(duì)照組均正常結(jié)果才有意義。 鼠腦接種 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種途徑很多，腦、腹腔、皮膚、皮下均可。本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)鼠腦接種。 抓老鼠，消毒眼耳連線中點(diǎn)，注射器取病毒液（染液代替)向其扎入，有鏤空感時(shí)即進(jìn)入顱骨，注射即可。 注入接種完就拉頸處死，進(jìn)行鼠腦收剖。 枕后部皮膚橫剪開，再縱剪，腦袋皮膚剝開，剪開顱骨，看看你的病毒液注射到哪個(gè)部位了，注射到的地方會(huì)被染藍(lán)。 真菌培養(yǎng) 真菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，菌落形態(tài)有兩種。 1. 酵母型菌落 是單細(xì)胞真菌的菌落形式，菌落光滑濕潤(rùn)，柔軟而致密。形態(tài)與一般細(xì)菌菌落相似，如隱球菌。有部分單細(xì)胞真菌在出芽繁殖后，芽管延長(zhǎng)不與母細(xì)胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向下生長(zhǎng)，伸入培養(yǎng)基中，這種菌落稱為酵母樣菌落，如假絲酵母菌。 2. 絲狀菌落 是多細(xì)胞真菌的菌落形式，由許多疏松的菌絲體構(gòu)成。菌落成棉絮狀、絨毛狀或粉末狀，菌落正背兩面呈現(xiàn)不同的顏色。絲狀菌落的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和顏色常作為鑒定真菌的參考。真菌有從中心向四周等距離生長(zhǎng)形成圓形菌落的傾向，所以臨床體癬、股癬、疊瓦癬等皮損表現(xiàn)為環(huán)形或多環(huán)形。 真菌培養(yǎng)常用大培養(yǎng)柯氏瓶點(diǎn)種接種。 若要區(qū)分酵母型和酵母樣菌落，可作小培養(yǎng)。載玻片上用蠟粘上鋼圈，加入一半培養(yǎng)基，，點(diǎn)種后蓋上無菌蓋玻片，培養(yǎng)后鏡檢觀察。 觀察。 大分生孢子 體積較大，由多個(gè)細(xì)胞組成，常呈梭狀、棍棒狀或梨狀，中間有分隔。其大小、細(xì)胞數(shù)和顏色是鑒定的重要依據(jù)。 小分生孢子 較小，1個(gè)孢子只有1個(gè)細(xì)胞，如小米粒狀。不是鑒定依據(jù)。
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