 |
 |
1.2.4 DAPI染色法檢測細胞凋亡 取固定好的細胞爬片，常規(guī)水化后滴加濃度為100ng/ml的DAPI染液，室溫染色10min，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長360-400nm。
陽性結果判斷：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期，Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)； a Ⅱ 期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化； b Ⅱ 期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
1.2.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR)檢測Bcl-2和Bax mRNA水平 細胞培養(yǎng)至完全匯合時，使用TaKaRa TRIZOL Reagent Kit，按說明書提取細胞總RNA進行RT-PCR反應。從Primer Bank中獲得人類Bcl-2和Bax基因引物序列。人Bcl-2上游引物為： 5- CCAAGAATGCAAAGCACACTG-3 ，下游引物：5-CCCAGCCTCCGTTATCCTG -3，擴增片段為711bp；Bax上游引物為：5-CTGGACAGTAACATGGAGCTG-3 ，下游引物為 5-GGCGTCCCAAAGTAGGAGA-3，擴增片段為296bp。人β-actin作為內(nèi)參照，引物序列如下：上游為5-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3，下游為5-CTCCTT AAT GTC ACG CAC GAT-3，擴增片段長度為250bp，引物由上海生工合成。PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠分析。醫(yī).學.全.在.線52667788.cn
1.2.6 Western blotting檢查磷酸化p38表達：用0.01M PBS沖洗培養(yǎng)融合至80%的細胞，加入450μl裂解液（1mM NaHCO3和10mM PMSF)后用細胞刮將細胞刮下收集到EP管中，15，000rpm離心，收集上清蛋白樣品，用BCA ProteinAssay Kit（美國Pierce公司)對每種蛋白樣品定量。每種樣品取20μg進行變性蛋白電泳，凝膠濃度為12%。電泳結束后將凝膠中蛋白轉到硝酸纖維素膜上（美國Millipore公司)，5%脫脂奶粉封閉過夜后，將硝酸纖維素膜放入一抗室溫孵育1h。洗膜后，將膜與HRP-結合的二抗室溫孵育1h。洗膜后用ECL Westernblotting system（美國GE公司)顯色。
1.2.7 統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（x±s)表示，并用SPSS軟件16.0進行t檢驗或單因素方差分析。
2 結果
2.1 Claudin-6誘導MCF-7細胞凋亡 為了檢測claudin-6是否能夠誘發(fā)MCF-7細胞凋亡，應用TUNEL法、DAPI stain和Annexin-V/PI double stain檢測各組細胞凋亡情況。結果顯示，實驗組細胞的凋亡率與vector組比較明顯增高。同時DAPI核染色發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定表達claudin-6的實驗組細胞中可見明顯的凋亡細胞核形態(tài)，即細胞核呈波紋狀，染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，部分細胞核裂解為碎塊。而control組細胞的自然凋亡率與vector組比較，差異無顯著性意義，結果如圖4所示。上述結果說明，claudin-6促進了MCF-7細胞凋亡。
2.2 Claudin-6刺激MCF-7細胞信號轉導途徑的激活 ERK、p38 MAPK和PI3KMAPK等信號途徑在細胞凋亡誘導中發(fā)揮了重要作用。 在claudin-6表達的MCF-7細胞中，claudin-6是否激活這些信號轉導途徑，從而參與細胞凋亡的調(diào)控？應用Western blot檢測各組細胞中上述信號途徑的激活情況。結果發(fā)現(xiàn)，在claudin-6表達的MCF-7細胞中p38 MAPK途徑明顯處于激活狀態(tài)，如圖5、6所示。上述結果提示claudin-6表達激活了p38 MAPK途徑。
2.3 抑制劑對不同信號途徑的抑制作用 為進一步明確p38 MAPK信號途徑在claudin-6介導信號轉導通路中的作用，我們應用該信號途徑特異性抑制劑，觀察其是否能選擇性阻斷相應的信號途徑：p38 MAPK抑制劑SB203508。應用Western blot檢測p38 MAPK信號途徑活化狀態(tài)，結果如圖7-12所示。結果發(fā)現(xiàn)p38 MAPK途徑的確能夠被特異性抑制劑SB203580明顯抑制，而claudin-6的表達未受影響。醫(yī).學.全.在.線52667788.cn
2.4 p38 MAPK信號途徑在表達claudin-6的MCF-7細胞中凋亡調(diào)控的作用 為明確p38 MAPK途徑在claudin-6誘導MCF-7細胞凋亡中的作用，我們用SB203580處理各組細胞，然后應用Western blot檢測各組細胞的凋亡情況。結果發(fā)現(xiàn)用SB203580阻斷p38MAPK途徑后，實驗組細胞claudin-6的促凋亡作用被抑制，出現(xiàn)細胞凋亡降低，如圖13、14所示。上述結果表明，MCF-7細胞中claudin-6的促凋亡作用是通過p38 MAPK途徑轉導的。
