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3 討論
Claudins 是構(gòu)成細(xì)胞緊密連接的一類重要的跨膜蛋白，其表達(dá)和定位對(duì)于緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的完整性都非常重要。Claudin-6 是 claudins 家族成員之一。近來的研究表明 claudins 表達(dá)改變與上皮來源的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)。在某些特定上皮來源腫瘤中 claudins 表達(dá)異常，例如 claudin-1 表達(dá)下調(diào)或claudin-3 和-4 上調(diào)能夠增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性，促進(jìn)瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。臨床上，某些claudins 表達(dá)異常是判斷侵襲性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。因此，確定claudins 在腫瘤發(fā)病中的作用能夠?yàn)槲覀兏钊氲牧私饽[瘤發(fā)生及惡變的機(jī)制提供幫助。
我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦锌寺『丸b定了腫瘤抑制相關(guān)基因claudin-6，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染claudin-6真核表達(dá)載體的MCF-7細(xì)胞單克隆，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)claudin-6后生物學(xué)行為發(fā)生了很大改變，比較突出的變化就是細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢并且出現(xiàn)了明顯的死亡，為驗(yàn)證這種死亡部分是由于細(xì)胞凋亡造成的我們對(duì)轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞進(jìn)行了凋亡的檢測(cè)并比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，claudin-6表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。
細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程，對(duì)于有機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，凋亡的缺失常常是腫瘤發(fā)生的原因之一。許多因素都可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而不同誘導(dǎo)因素可經(jīng)不同途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同一種誘導(dǎo)因素在不同條件下的作用機(jī)制也不盡相同。因此，我們推測(cè) MCF-7 細(xì)胞中 claudin-6 表達(dá)的缺失導(dǎo)致細(xì)胞逃避了凋亡，并且在癌變過程中發(fā)揮了一定的作用。而且，Makoto 等人發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞中 claudin-6基因表達(dá)沉默使細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性降低。此外該研究組證明抑制 occludin 能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)致凋亡因素的抵抗性增加以及能逃逸細(xì)胞老化程序，因此增強(qiáng)了癌細(xì)胞的致癌、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。
目前關(guān)于claudins誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究甚少，因此本研究為探討claudins促瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)理提供了線索。
本文報(bào)道了在MCF-7細(xì)胞系中，claudin-6表達(dá)上調(diào)能明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑瘤作用。凋亡在防止癌癥的發(fā)生和維持阻止穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要的作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)凋亡活性的缺失促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。因此，更好理解claudin-6表達(dá)缺失誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。 此外，claudin-6的表達(dá)也降低了癌細(xì)胞的惡性表型，如侵襲和遷移活性，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。
接著我們對(duì)claudin-6誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。至今，關(guān)于claudins參與的信號(hào)通路研究甚少，但是發(fā)現(xiàn)其與一些信號(hào)通路有關(guān)。如Taddei等人發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在鼠胚胎干細(xì)胞中claudin-5表達(dá)上調(diào)時(shí)PI(3)K–Akt pathway途經(jīng)被激活。Kun Zhang等人發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系T47D中claudin-1表達(dá)下調(diào)能夠激活Erk1/2途經(jīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增加。此外，Oshima等人發(fā)現(xiàn)應(yīng)用阿司匹林處理人類胃癌細(xì)胞系MKN28能通過claudin-7激活p38 MAPK途徑，降低單層培養(yǎng)細(xì)胞的跨上皮電阻，提高跨上皮的滲透性。因此，我們檢測(cè)了細(xì)胞在轉(zhuǎn)染claudin-6前后上述通路的活化狀態(tài)， 同時(shí)應(yīng)用各通路抑制劑進(jìn)一步確定上述通路在claudin-6誘導(dǎo)凋亡中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比p38 MAPK途徑在claudin-6表達(dá)細(xì)胞中處于高度活性狀態(tài)，而被檢的其它信號(hào)蛋白磷酸化Erk1/2和Akt在各組間沒有明顯差別。隨后我們應(yīng)用通路特異性抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證了假設(shè)。結(jié)果表明應(yīng)用通路特異性抑制劑后磷酸化的p38明顯減少，而其它被檢的信號(hào)蛋白改變不明顯。p38 MAPK途徑主要參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，還參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化。近來研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞在受到不同刺激影響時(shí)，p38 MAPK所扮演的角色是完全不同的。一些研究者發(fā)現(xiàn)p38 MAPK途徑活化通過介導(dǎo)caspase激活或p53磷酸化誘導(dǎo)凋亡p38 MAPK參與細(xì)胞凋亡過程，與誘導(dǎo)bax轉(zhuǎn)位；介導(dǎo)caspase的活化；p53磷酸化及增強(qiáng)TNF的表達(dá)介導(dǎo)的凋亡有關(guān)。但也有研究表明，p38MAPK信號(hào)通路也通過抑制前凋亡信號(hào)的產(chǎn)生，參與介導(dǎo)細(xì)胞存活信號(hào)通路而抑制細(xì)胞凋亡。在本研究中，p38在claudin-6表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中明顯處于活化狀態(tài)，加入抑制劑后可明顯抑制其活化。因此，我們假設(shè)應(yīng)用通路特異性抑制劑也能影響到claudin-6介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移表型。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們檢測(cè)了應(yīng)用p38通路特異性抑制劑前后細(xì)胞的凋亡、侵襲和遷移活性。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，claudin-6表達(dá)克隆C2的細(xì)胞凋亡明顯降低（Fig.3A right，C2)，克隆C1的細(xì)胞凋亡率也呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。我們的結(jié)果表明，表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞凋亡部分是由p38 MAPK途徑介導(dǎo)的。此外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)p38途徑受到抑制時(shí)，claudin-6表達(dá)的MCF-7的侵襲和遷移活性增高。眾所周知侵襲和遷移活性能夠反映腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，我們的結(jié)果表明claudin-6可能通過p38 MAPK信號(hào)通路降低了細(xì)胞侵襲活性。至今，關(guān)于claudins參與p38 MAPK信號(hào)途徑的研究少有報(bào)道。因此，本研究為claudins參與的信號(hào)通路增加了新的觀點(diǎn)。醫(yī).學(xué).全.在.線52667788.cn
總之，我們的結(jié)果表明在某種特定腫瘤中claudin-6是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因。但是，我們目前的研究我們并未弄清claudin-6是如何通過p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞表型的。下一步的研究我們將著眼于claudin-6參與腫瘤抑制的精確分子機(jī)制。在某些特定腫瘤中恢復(fù)內(nèi)源性claudin-6的表達(dá)可能作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要治療手段。
