 |
 |
雌激素活體（estroqen receptor，ER)是抗雌激素類藥物內(nèi)分泌治療的靶點(diǎn)，也是預(yù)后的重要指標(biāo)[1-4]。ER陰性或表達(dá)下調(diào)是內(nèi)分泌治療失敗及預(yù)后不良的因素。約1/4乳腺癌組織無ER表達(dá)，并且原先ER陽性的乳腺癌患者在腫瘤進(jìn)程中有1/3轉(zhuǎn)為ER陰性[5]。有文獻(xiàn)報道，ER陰性與基因的變異（如插入、缺失、重組或點(diǎn)突變等)未發(fā)現(xiàn)有明確的聯(lián)系，而DNA甲基化是其表達(dá)失活的主要原因之一[6]。研究顯示，啟動子異常甲基化在許多腫瘤的發(fā)生過程中是一個頻發(fā)的早期事件，因此腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)是腫瘤發(fā)生的一個早期敏感指標(biāo)，可以作為一種有前景的腫瘤分子標(biāo)志物。本研究運(yùn)用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)分別檢測正常乳腺組織、乳腺癌組織ERα基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，分析乳腺癌ERα啟動子甲基化與其蛋白表達(dá)及臨床病理的關(guān)系，進(jìn)一步探討ERα啟動子甲基化作為乳腺癌臨床診斷和治療的分子標(biāo)志物的可能性，為腫瘤去甲基化治療提供理論依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 標(biāo)本來源 由溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科提供新鮮組織標(biāo)本。包括20例正常乳腺組織和44例乳腺癌組織。病理組織學(xué)分型(WHO標(biāo)準(zhǔn))：浸潤性癌33例，浸潤性小葉癌伴浸潤性導(dǎo)管癌1例，黏液腺癌3例，導(dǎo)管內(nèi)癌5例，髓樣癌2例�；颊呔鶠榕浴Ｄ挲g27～78歲，平均(48.7±8.9)歲。
1.2 免疫組化EnVisionTM二步法 抗ERα抗體和通用型二步法檢測試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。染色操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗為空白對照。以試劑盒中提供的已知陽性片為陽性對照。ER陽性物質(zhì)(棕黃色)位于胞核。每張切片隨機(jī)選擇10個高倍視野，每個視野隨機(jī)觀察100個細(xì)胞，計算其中陽性細(xì)胞比例(陽性細(xì)胞按染色棕褐、棕黃、淺黃分別乘以系數(shù)1、2/3、1/3來計算數(shù)目)。ER陽性細(xì)胞比例≥10%計作陽性。
1.3 DNA提取 新鮮組織標(biāo)本，經(jīng)蛋白酶K消化，酚、氯仿、異戊醇法提取DNA，并測定DNA濃度和含量。
1.4 DNA亞硫酸氫鹽修飾 加熱變性，NaHSO3修飾，透析除鹽，沉淀，溶解等操作方法參見文獻(xiàn)[7]。DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后，CpG島中的非甲基化胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)；而CpG島中的甲基化胞嘧啶(mC)仍保留為胞嘧啶。CpG島以外序列中的胞嘧啶(C)均轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后均為胸腺嘧啶(T)。
1.5 PCR擴(kuò)增ERα基因醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站52667788.cn
1.5.1 引物、主要試劑和儀器：ERα基因序列號為NM_000125。各個引物序列詳見參考文獻(xiàn)[8]。均由上海生物工程公司合成。野生型引物W擴(kuò)增未修飾的啟動子區(qū)。非甲基化引物U、甲基化引物M分別擴(kuò)增經(jīng)修飾后的非甲基化和甲基化啟動子區(qū)。Taq DNA聚合酶購自大連寶生物公司，PxZ型PCR擴(kuò)增儀為Thermo Hybaid公司產(chǎn)品，BioSens SC 620型紫外凝膠分析系統(tǒng)為上海山富科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。
1.5.2 PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及結(jié)果觀察：50μL的反應(yīng)體系含MgCl2 2.0 mmol/L、正向引物和反向引物0.8μmol/L、四種dNTP每種終濃度0.4 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板1μg。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火(溫度、時間詳見參考文獻(xiàn)[8])，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 8 min延伸。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠分析系統(tǒng)觀察拍照。
1.6 PCR產(chǎn)物直接測序 提供啟動子A、B區(qū)非甲基化引物和甲基化引物的PCR產(chǎn)物，由大連寶生物技術(shù)有限公司純化和直接測序。
1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 率的比較采用x2檢驗(yàn)，根據(jù)x2值計算Pearson列聯(lián)系數(shù)。
