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1.2.2 MTT法測定PAMD和伊馬替尼(IM,STI571)的細胞毒性[2] 取對數(shù)生長期的K562/S和K562/MDR1細胞,配制成1×105/ml單細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.1 ml,實驗組分為兩組,一組加入PAMD至終濃度為40,20,10,5,2.5,1.25,0.625 mg/L,另一組加入STI571至終濃度為5,2.5,1.25,0.625,0.315 μmol/L,每個藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔,空白對照組不加藥,置于37℃飽和濕度5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)72 h,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml),再置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取上清液,每孔加入100 μl DMSO振蕩5 min,用酶聯(lián)儀在570 nm波長下測光密度,同時計算各組細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),按下列公式計算耐藥細胞的耐藥倍數(shù)。同時測定PAMD的IC10,選取低于IC10的藥物濃度進行逆轉(zhuǎn)研究[3]。
耐藥倍數(shù)=耐藥細胞的IC50/敏感細胞的IC50。
1.2.3 MTT法測定細胞的藥敏性 取對數(shù)生長期的K562/MDR1細胞,配制成1×105/ml 單細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.1 ml,各組加入STI571至終濃度為5,2.5,1.25,0.6,0.3 μmol/L,同時每組加入終濃度為0.625 mg/L的PAMD逆轉(zhuǎn)劑,每個藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔。同“1.2.2”方法測定D/(570) nm,按STI571濃度抑制率曲線計算出IC50,求出逆轉(zhuǎn)劑PAMD作用后的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。
逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細胞逆轉(zhuǎn)前的IC50/耐藥細胞逆轉(zhuǎn)后的IC50
1.2.4 流式細胞術(shù)(FCM)檢測逆轉(zhuǎn)后耐藥細胞的凋亡百分率 取對數(shù)生長期的K562/MDR1細胞,調(diào)整細胞的初濃度,實驗組分別加入STI571至終濃度為5,2.5,1.25,0.625,0.315 μmol/L,同時每組加入終濃度為0.625 mg/L逆轉(zhuǎn)劑,陰性對照組加入等體積的RPMI1640培養(yǎng)基。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后收集細胞,AnnexinVFITC/PI雙染后上流式細胞儀進行檢測,每份標本設(shè)一個復(fù)管,重復(fù)1次,計算凋亡細胞百分數(shù)。
1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0 軟件包處理,數(shù)據(jù)以±s表示,t檢驗計算比較實驗和對照各組的D值。采用線性回歸計算IC50。
2 結(jié) 果
2.1 PAMD誘導后K562/S和K562/MDR1細胞凋亡百分率 AnnexinVFITC/PI雙參數(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡情況,細胞凋亡流式散點圖上可見實驗組細胞凋亡明顯高于對照組,低濃度的PAMD(0.625～10.0 mg/L)作用72 h凋亡細胞百分率呈劑量依賴性,Ⅳ象限細胞(FITC+,PI-)增加并隨藥物濃度遞增比例提高,當劑量大于10 mg/L時,Ⅱ象限(PI+，F(xiàn)ITC+)凋亡后壞死細胞和部分壞死細胞明顯增多(圖1)。凋亡率為Ⅳ象限細胞占全部細胞的百分率(表1)。表1 蝙蝠葛酚性堿誘導K562/MDR1和K562/S細胞凋亡率的影響
2.2 PAMD和STI571的細胞毒性及耐藥細胞的耐藥倍數(shù) PAMD和STI571分別對K562/MDR1和K562/S細胞都存在顯著的細胞毒性作用,且呈明顯的量效關(guān)系。不同濃度的PAMD和STI571對親本細胞和耐藥細胞的抑制率曲線見圖2,圖3。通過回歸方程計算PAMD對K562/MDR1和K562/S的IC50分別為11.57 mg/L和7.59 mg/L,兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明K562/MDR1細胞對PAMD沒有耐藥性。同時測得STI571對K562/MDR1和K562/S的IC50分別為8.27 μmol/L和1.83 μmol/L,即K562/MDR1細胞對STI571的耐藥倍數(shù)為4.52倍。
2.3 細胞藥敏性及對耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)
PAMD對K562/MDR1的IC10為0.632 mg/L,因此把低于IC10劑量(0.625 mg/L)的PAMD作為最佳逆轉(zhuǎn)濃度。STI571單獨作用于K562/MDR耐藥細胞72 h的IC50為8.27 μmol/L,STI571與低于IC10劑量的PAMD共同作用72 h后,K562/MDR1耐藥細胞的IC50降低為3.72 μmol/L,但仍遠遠高于對敏感細胞K562/S的值1.83 μmol/L,STI571對多耐藥細胞K562/MDR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.22倍(圖4)醫(yī).學.全.在.線52667788.cn。
2.4 逆轉(zhuǎn)后耐藥細胞K562/MDR1的凋亡率
各濃度的STI571與0.625 mg/L的PAMD聯(lián)合應(yīng)用作用于多藥耐藥K562/MDR1細胞72 h后,K562/MDR1未處理組自然凋亡率為(3.05±0.05)%,STI571的各濃度單獨應(yīng)用以及與0.625 mg/L的PAMD聯(lián)合應(yīng)用結(jié)果見表2。由此可見,當STI571與低于IC10劑量的PAMD聯(lián)合應(yīng)用時,可以顯著提高K562/MDR1細胞的凋亡率(P<0.01)。表2 PAMD對逆轉(zhuǎn)后耐藥細胞K562/MDR1凋亡率的影響
3 討 論
腫瘤多藥耐藥的實質(zhì)是腫瘤細胞對治療藥物的防御與適應(yīng)的一種反應(yīng)。自從Biedle發(fā)現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象以來,國內(nèi)就對腫瘤細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)進行熱點研究。目前研究發(fā)現(xiàn),藥物分布及攝取、代謝與失活、藥物作用效靶、DNA損傷與修復(fù)以及凋亡途徑改變等多種機制參與多藥耐藥的形成,其中主要機制之一是細胞過量表達了一種P糖蛋白(Pglycoprotein,Pgp),它通過消耗ATP主動把細胞內(nèi)化療藥物從細胞內(nèi)快速“泵出”,使細胞內(nèi)藥物濃度下降,導致細胞內(nèi)藥物聚集減少,從而產(chǎn)生多藥耐藥性。在體外具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用的耐藥調(diào)節(jié)劑主要包括:鈣通道阻滯劑(異博定),鈣調(diào)蛋白拮抗劑(三氟丙嗪),免疫調(diào)節(jié)劑(環(huán)孢素A),抗生素類(紅霉素)以及干擾素(IFNα)等。盡管體外實驗證明這些藥物能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤化療藥物的耐藥,但它們在臨床應(yīng)用時多受到禁忌證多、不良反應(yīng)大、藥效不穩(wěn)定、難以作用到靶點等因素的影響。如異博定、環(huán)孢素A等雖然已經(jīng)進入臨床試驗階段,但是它們明顯的不良反應(yīng)限制了臨床應(yīng)用,療效也不是很理想[4]。因而迫切需要尋找其他治療指數(shù)更大、確有臨床價值的化療增敏劑。
研究證實,鈣拮抗劑通過破壞Pgp的功能,競爭性抑制Pgp的外排而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥,從而達到增強化療效果的目的[5]。研究發(fā)現(xiàn),鈣通道阻滯劑異喹啉類生物堿具有一定的逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的作用。田暉等[6]研究發(fā)現(xiàn)雙芐基異喹啉生物堿——蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對天然耐藥的BEL7402細胞和獲得性耐藥的MCF7/Adr、KBV200細胞均有明顯逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。田春艷等[7]在對從中藥功勞木的根中提取的一種異喹啉類生物堿研究發(fā)現(xiàn),它能增加多柔比星對K562/ADM的細胞毒作用,提高其對耐藥細胞K562/ADM的殺傷性,部分逆轉(zhuǎn)了K562/ADM細胞的耐藥。
