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公開(公告)號
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CN1200102C
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公開(公告)日
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2005.05.04
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申請(專利)號
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CN02155220.7
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申請日期
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2000.06.23
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專利名稱
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家畜用去勢重組基因載體
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主分類號
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C12N15/13
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分類號
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C12N15/13;C12N15/11;C12N15/63;C12P19/34;A61K48/00;A61K31/7088
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分案原申請?zhí)? |
00107831.3
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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成都瑞盛高科技有限責(zé)任公司
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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吉傳義;杜念興;朱杰青;龔光明
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地址
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610041 四川省成都市高新區(qū)高朋東路3號21D
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
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代理人
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錢寶英
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國省代碼
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四川;51
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主權(quán)項(xiàng)
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家畜用去勢重組基因載體，是通過以下方法構(gòu)建獲得的：1)LHRH基因片段的退火人工合成的家畜用去勢疫苗基因片段L1：5′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子XhoI將人工合成的家畜用去勢疫苗基因片段的正鏈和負(fù)鏈，分別用滅菌超純?nèi)芙獬蓾舛葹?00pmol/l的溶液，各取2μl加入72μl超純水中混勻，置沸水浴中2min后緩慢冷卻至室溫，-20℃凍存?zhèn)溆茫?)LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI對退火后的LHRH基因進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物直接用于連接反應(yīng)；3)pET-32c質(zhì)粒的提取、酶切及回收pET--32c質(zhì)粒的提取后，用NcoI及XhoI對PET-32c質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切大片段，置液氮中凍5min，而后置37℃水浴融化，10000r/min離心10min，吸取上清-20℃凍存?zhèn)溆茫?)連接DNA連接反應(yīng)體系如下：PET-32c雙酶切回收產(chǎn)物2.5μlLHRH基因酶切產(chǎn)物7.5μlDNALigationKitSolutionI10μl上述混合物16℃反應(yīng)30min后立即用于轉(zhuǎn)化；5)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備；6)轉(zhuǎn)化取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含Amp50μg/ml的LB瓊脂平板，平板置37℃溫箱中培養(yǎng)18小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落，接種含Amp的LB肉湯擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒。
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摘要
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本發(fā)明家畜用去勢重組基因載體，用于生產(chǎn)家畜家禽去勢基因工程亞單位疫苗，屬于生物技術(shù)高科技領(lǐng)域。其方法如下：人工合成畜用、禽用或畜禽通用的LHRH基因片段，其5′端和3′端分別加有NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)，插入pET-32c質(zhì)粒，構(gòu)建成4種表達(dá)LHRH-Trx融合蛋白的pET-32c LHRHn-N/X重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白，便于提取純化，家畜、家禽通用，免疫雞、豬、羊、兔、犬、貓等動(dòng)物，可有效去勢。圖為重組質(zhì)粒pET-32c LHRHn(L1、L2、L3、L4)-N/X的構(gòu)建。
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國際公布
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