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六、蛋白質(zhì)的分離與純化:
1.鹽析與有機溶劑沉淀:在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出,稱為鹽析。常用的中性鹽有:硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時,溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點處效果最好。凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質(zhì)沉淀。
2.電泳:蛋白質(zhì)分子在高于或低于其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動。電泳遷移率的大小主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷量以及分子大小。
3.透析:利用透析袋膜的超濾性質(zhì),可將大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分離開。
4.層析:利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異,在相互接觸的兩相(固定相與流動相)之間的分布不同而進行分離。主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附層析及親和層析等,其中凝膠層析可用于測定蛋白質(zhì)的分子量。
5.超速離心:利用物質(zhì)密度的不同,經(jīng)超速離心后,分布于不同的液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)的分子量,蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比。
七、氨基酸順序分析:
蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸順序分析,即蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,主要有以下幾個步驟:
1. 分離純化蛋白質(zhì),得到一定量的蛋白質(zhì)純品;
2. 取一定量的樣品進行完全水解,再測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成;
3. 分析蛋白質(zhì)的N-端和C-端氨基酸;
4. 采用特異性的酶(如胰凝乳蛋白酶)或化學試劑(如溴化氰)將蛋白質(zhì)處理為若干條肽段;
5. 分離純化單一肽段;
測定各條肽段的氨基酸順序。一般采用Edman降解法,用異硫氰酸苯酯進行反應(yīng),將氨基酸降解后,逐一進行測定;
7. 至少用兩種不同的方法處理蛋白質(zhì),分別得到其肽段的氨基酸順序;
8. 將兩套不同肽段的氨基酸順序進行比較,以獲得完整的蛋白質(zhì)分子的氨基酸順序。
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