臨床生物化學(xué):第一節(jié)　光譜分析技術(shù)的應(yīng)用

一、光譜分析技術(shù)的分類

利用各種化學(xué)物質(zhì)（包括原子、基團(tuán)、分子及高分子化合物)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜系的特征，來確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)，稱為光譜分析技術(shù)。根據(jù)光譜譜系的特征不同，可把光譜分析技術(shù)分為發(fā)射光譜分析、吸收光譜分析和散射光譜分析三大類。

在臨床生化檢驗(yàn)中，光譜分析是一類十分重要的技術(shù)，應(yīng)用極為廣泛。應(yīng)用吸收光譜原理進(jìn)行分析的主要有可見光及紫外光分光亮度法，以及原子吸收分光亮度法。紅外分光亮度法雖然也屬于吸收光譜法，但在臨床生化上應(yīng)用不多。應(yīng)用發(fā)射光譜原理進(jìn)行分析的主要有熒光分析法和火焰亮度法。應(yīng)用散射光譜原理進(jìn)行分析的主要是比濁法，包括免疫比濁法等。

二、光譜分析的常用方法

（一)吸收光譜分析法

1、可見光及紫外光分光亮度法

（1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法：將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過程顯色后，分別測吸亮度，以吸亮度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下處理待測物質(zhì)并測定其吸亮度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對應(yīng)的濃度。

（2)對比法：將標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測樣品在相同條件下顯色并測定各自的吸亮度。由于測定體系溫度、厚度以及入射光波長是一致的，所以標(biāo)準(zhǔn)與待測樣品K值及L相等，可應(yīng)用下式比較計算待測樣品濃度：Cx=Cs×As／Ax。

（3)差示法：有色溶液濃度太濃或太�。ㄍ腹舛瘸�過90%-10%)時，測定結(jié)果會產(chǎn)生較大誤差，此時可采用差示法（differentialspectrophotometry)。①高濃度樣液差示法：用標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度稍低于試樣的參比溶液，先將儀器光門關(guān)閉，調(diào)節(jié)T%=0，再將參比溶液置于光路上，打開光門使T%=100，然后測定樣品溶液的透光率即可。例如某一樣品溶液原來的透光率讀數(shù)為5%（10%以下)，用差示法后讀數(shù)為50%，這實(shí)質(zhì)是把透光率標(biāo)尺擴(kuò)展了10倍，從而減少了測量誤差。②低濃度樣液差示法：用標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度稍高于試樣的參比溶液，將它放在光路上，打開光門，調(diào)節(jié)透光率至0%，然后換以空白溶劑，調(diào)節(jié)刻度至100%。此后測定樣品的讀數(shù)即可。

（4)多組分混合物的測定：當(dāng)試樣中有兩種或兩種以上的組分共存，可根據(jù)各組分的吸收光譜的重疊程度，選用不同的定量方法。如果混合物各組分的吸收峰互不干擾，這時可按單組分的測定方法，選擇測定波長，分別測定各組分的含量；若各組分的吸收峰相互重疊，可采用解聯(lián)立方程法、等吸收點(diǎn)法、雙波長法等解www.med126.com決量中的干擾問題。

（5)利用摩爾吸光系數(shù)進(jìn)行檢測：①吸光系數(shù)：Beer定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為A=kbc，若溶液的濃度c以g/L為單位，b為光徑以cm為單位，則常數(shù)K稱為吸光系數(shù)，以a表示，其單位為升/（克·厘米)[L/(g·cm],A=kbc可寫成A=abc。②摩爾吸光系數(shù)：公式A=kbc中的以為1mol/L,b為1cm時，則系數(shù)k稱為摩爾吸光系數(shù)，以ε表示，單位為升/（摩爾·厘米)[L/(mol·cm)]，A=kbc可寫成A=εc。在實(shí)際工作中，不能直接用1mol/L這種高濃度的溶液測定吸光度，而是在稀釋成適當(dāng)濃度時測定吸光度進(jìn)行運(yùn)算。ε值與入射光波長、溶液的性質(zhì)等因素有關(guān)。如NADH在260nm時ε為15000，寫成ε₂₆₀^NADH=15×10³；在340nm時ε為6220，寫成ε₃₄₀^NADH=6.22×10³。③比吸光系數(shù)：如公式A=kbc中的c是百分濃度（w/v)b為cm，則常數(shù)k可用E^%表示，稱為比吸光系數(shù)或百分吸光系數(shù)，A=kbc可寫成A=E^%bc。當(dāng)待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是已知者可用ε值分析，若所測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是未知的，則ε無法確定，此時用比吸光系數(shù)分析就很方便。a、ε和E常用作粗定量分析，主要用于定性分析。

近年來由于新的靈敏度高、選擇性好的顯色劑和掩蔽劑不斷出現(xiàn)，一般不經(jīng)分離過程即可直接比色測定。幾乎所有的無機(jī)離子和有機(jī)物都可直接或間接用可見光及紫外光分光光度法進(jìn)行定量測定。

2、原子吸收分光光度法　原子吸收光光度法是基于元素所產(chǎn)生的原子蒸氣中，待測元素的基態(tài)原子，對所發(fā)射的特征譜線的吸收作用進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)。具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，對大部分元素，其靈敏度約為10^-8～10^-10g/ml，是微量元素檢測的一個十分有鏟的方法之一。

（1)分析條件的選擇

1)分析線：原子吸收法中常選擇待測元素的共振作分析線，但并不是任何情況下都應(yīng)使用共振線，例如As、Se、Hg的共振線在遠(yuǎn)紫外區(qū)，該區(qū)域火焰吸收強(qiáng)烈，不宜選用共振線作分析線。在選擇分析線時，首先掃描空心陰極燈的發(fā)射光譜，然后噴入試樣溶液，觀察譜線的吸收和干擾情況，一般選用不受干擾且吸收最強(qiáng)的譜線作為分析線。常用元素分析線見表16-1。

表16-1　常用元素分析線

2)狹縫寬度的選擇：適宜狹縫寬度可由實(shí)驗(yàn)確定：將試樣噴入火焰，調(diào)節(jié)狹縫寬度，測定不同狹縫寬度時的吸光度，達(dá)到一定寬度后，吸光度趨于穩(wěn)定，進(jìn)一步增加狹縫寬度，當(dāng)其他譜線或非吸收透過狹縫時，吸光度立即減小。不引起吸光度減小的最大狹縫寬度，就是最適宜的狹縫寬度。

3)原子化條件的選擇：對于火焰原子化法，火焰的種類和燃助比的選擇是很重要的。當(dāng)燃?xì)夂椭�燃�(xì)膺x擇好后，可通過下述方法選擇燃助比：固定助燃?xì)饬髁�，改變�(nèi)細(xì)饬髁�，測量標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同燃助比時的吸光度，繪制吸光度-燃助比關(guān)系曲線，以確定最佳燃助比。

對于石墨爐原子化器的使用。應(yīng)注意干燥是一個低溫去溶劑的過程，可在稍低于溶劑沸點(diǎn)的溫度下進(jìn)行。灰化是為了破壞和去除試樣基體，故在保證試樣無明顯損失的前提下，將試樣加熱到盡可能高的溫度。原子化階段應(yīng)選擇最大吸收信號的最低溫度�？傊�，根據(jù)試樣的性質(zhì)確定各階段所選定的溫度與加熱時間。

4)試樣量的選擇：火焰原子化法在一定范圍內(nèi)，噴入的試樣量增加，原子吸光度增大，但在超過一定量后，由于試樣不能完全有效地原子化及試液的冷卻效應(yīng)會使吸光度不再增大甚至有所下降。因此在保持一定的火焰條件下，測定吸光度隨噴入試樣量的增加達(dá)到最大吸光度時的噴霧量，就是適宜的試樣量。石墨爐原子化一般固體取樣0.1～10mg，液體取樣量為1～50μl，主要依石墨管容器的大小而定。

（2)定量方法：常用的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法和內(nèi)標(biāo)法。

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法：同紫外可見標(biāo)準(zhǔn)曲線法。但由于燃?xì)饬髁亢蛧婌F效率的變化，單色器波長的漂移等因素可導(dǎo)致樣品測試條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定條件不同，所以，在測定未知樣品時，應(yīng)隨時對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢查，每次實(shí)驗(yàn)都要重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)標(biāo)準(zhǔn)加入法：在標(biāo)準(zhǔn)曲線法中，一般情況下要求標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知溶液的組成保持一致。但在實(shí)際工作中不是總能做到的，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法可以克服這個缺點(diǎn)。本法把未知試樣溶液分成體積相同的若干份，留其中一份，其余分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，然后測定各溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品加入量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖16-1)。由于未知樣品中含待測組分，故直線不通過原點(diǎn)而是在吸光度高于原點(diǎn)的A₀處與縱軸相交，且直線外推法使工作曲線延長交橫軸處于B點(diǎn)，則OB所對應(yīng)的濃度Cx就是未知試樣中待測組分濃度。

圖16-1 標(biāo)準(zhǔn)加入法工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)加入法的優(yōu)點(diǎn)是能夠更好地消除樣品中其它成分對測定的影響。

3)內(nèi)標(biāo)法：在系列標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品中加入一定量試樣中不存在的元素（內(nèi)標(biāo)元素)，然后測得As和Ax，以As/Ax比值對標(biāo)準(zhǔn)樣品中待測元素濃度C繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未加內(nèi)標(biāo)元素的試樣A與加入內(nèi)標(biāo)元素的試樣As比值（A/As)即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試樣中待測元素濃度。

本法要求內(nèi)標(biāo)元素應(yīng)與待測元素有相近的物理和化學(xué)性質(zhì)。此外，內(nèi)標(biāo)法只適用于雙通道型原子吸收分光光度計。

（二)發(fā)射光譜分析法

1、熒光分析法　許多物質(zhì)都是光致發(fā)光的，即它們可以吸收電磁輻射，然后又重新發(fā)射出相同或較長波長的輻射。光致發(fā)光最常見的類型是熒光（fluorescence)和磷光（phosphorescence)。利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法，稱為熒光法（fluorimetry)。在熒光分析中，待測物質(zhì)分子成為激發(fā)態(tài)時所吸收的光稱為激發(fā)光，處于激發(fā)態(tài)的分子回到基態(tài)時所產(chǎn)生的熒光稱發(fā)射光。熒光法測定的是受光激發(fā)后所發(fā)射的熒光的強(qiáng)弱，而不是測定激發(fā)光的強(qiáng)弱。凡能產(chǎn)生熒光的化合的，均可采用熒光分析法進(jìn)行定性或定量。

（1)熒光強(qiáng)度的影響因素

1)溶劑：增大溶劑的極性，將使π-π^※躍遷的能量降低，熒光增強(qiáng)。在水、乙醇、環(huán)已烷等這些常用溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測定，必須在使用前作凈化處理。

2)熒光物質(zhì)的濃度：對于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定頻率和一定強(qiáng)度的放射光Ⅰ。照射下，如果光被吸收的百分率不太大，且溶液的濃度很小，當(dāng)溶液的厚度不變時，則它所發(fā)生的熒光強(qiáng)度F和該溶液的濃度C成正比，即F=φⅠ。ECL式中φ為熒效率。當(dāng)熒光物質(zhì)濃度高時，會發(fā)生分子間碰撞，使熒光效率降低。因?yàn)闇囟仍龈吆笫狗肿娱g碰撞次數(shù)增加，消耗分子的內(nèi)部能量。

3)溫度：大多數(shù)情況隨溫度升高時，熒光效率降低。因?yàn)闇囟仍龈吆笫狗肿娱g碰撞次數(shù)增加，消耗分子的內(nèi)部能量。

4)溶液的PH值：當(dāng)熒光物質(zhì)本身為弱酸或弱堿時，溶液的pH值改變對溶液熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響較大，因?yàn)橛行┪镔|(zhì)在離子狀態(tài)時無熒光，而有些則相反，也有二者均有熒光，但熒光光譜有所不同。

（2)熒光定量分析法：熒光定量分析法通常有標(biāo)準(zhǔn)對比法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法。操作和計算可參照比色法，但應(yīng)注意，空白溶液的熒光強(qiáng)度F。往往不在零點(diǎn)，用上述兩種方法時應(yīng)先測定F，再從標(biāo)準(zhǔn)品Fs和試樣Fx中減去F。后進(jìn)行計算。

多組分混合物在熒光分析也可根據(jù)熒光峰相距情況采取不同的方法，如各組分熒光峰相距頗遠(yuǎn)，可分別在不同波長測定各個組分的熒光強(qiáng)度，然后直接求出各組分濃度。如果各組分熒光光譜相互重疊，利用熒光強(qiáng)度的加和性質(zhì)，在適宜熒光波長處，測得混合物的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)被測物質(zhì)各自在適宜波長處的最大熒光強(qiáng)度，列出聯(lián)立方程式求算各自的含量。

對較高濃度的熒光物質(zhì)可用差示熒光法測定。

（3)熒光分析技術(shù)的應(yīng)用：熒光分析法靈敏度高，選擇性好、取樣量少，因此已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，在臨床生化檢驗(yàn)方面可用于某些無機(jī)物與有機(jī)物的分析。

無機(jī)化合物能直接產(chǎn)生熒光并用于測定的為數(shù)不多，但與有機(jī)試劑絡(luò)合后進(jìn)行熒光分析的元素已達(dá)60余種，常見無機(jī)物的熒光測定見表16-2。

表16-2　常見無機(jī)物的熒光測定

某些有機(jī)化合物的熒光測定應(yīng)用較多，如糖類、胺類、甾族化合物、DNA與RNA、酶與輔酶、維生素等。常見有機(jī)化合物的熒光測定法見表16-3。

表16-3 常用有機(jī)化合物熒光測定法

2、火焰光度法火焰光度法是利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時發(fā)射的光譜強(qiáng)度進(jìn)行含量分析的方法。它在儀器結(jié)構(gòu)和分析操作上與火焰原子吸收法相似。

在火焰光度法中，試液和助燃?xì)庖黄疬M(jìn)入霧化室，霧化后噴入火焰，霧粒在火焰中蒸發(fā)和激發(fā)，激發(fā)態(tài)原子降落到低能態(tài)時發(fā)生光輻射，經(jīng)單色器分光后到達(dá)檢測器，然后由顯示系統(tǒng)顯示其發(fā)射光強(qiáng)度。

試樣中的待測元素激發(fā)態(tài)原子的發(fā)射光強(qiáng)度Ｉ與該元素濃度C成正比關(guān)系，即I=aC。式中a為常數(shù)。a與試樣的組成、蒸發(fā)和激發(fā)過程有關(guān)。

火焰光度法同樣存在各種因素干擾，如供氣壓力，試樣導(dǎo)入量、有機(jī)溶劑和無機(jī)酸的影響，以及金屬元素間的相互作用等，某些干擾因素的消除方法同原子吸收法。對于金屬離子間的相互作用可以下述方法予以消除：

（1)陽離子的干擾：第二陽離子的存在可使待測陽離子的電離作用降低而導(dǎo)致以元素形式存在居多，結(jié)果發(fā)射強(qiáng)度增大，這種現(xiàn)象稱為陽離子增強(qiáng)效應(yīng)。例如測定鈣時有鉀存在，鉀可抑制鈣的電離，干擾鈣的測定。消除這種干擾的辦法是在標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣中加入本身易電離的金屬如銫和鋰。

（2)陰離子干擾：草酸根、磷酸根和硫酸根可與某些陽離子在火焰溫度下形成僅能緩慢蒸發(fā)的化合物而抑制原子激發(fā)，結(jié)果導(dǎo)致待測元素發(fā)射強(qiáng)度降低。消除這種干擾的辦法是用釋放劑。釋放劑的作用是同干擾陰離子牢固結(jié)合，使待測陽離子的激發(fā)行為不受干擾，或與待測陽離子形成更穩(wěn)定而易揮發(fā)的配合物。故盡量避免使用磷酸、硫酸、草酸做試劑。

此外，應(yīng)避免環(huán)境污染測試體系。使用的器皿應(yīng)為塑料制品以防止玻璃器皿中金屬溶出干擾測定。

火焰光度法通常采用的定量方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法和內(nèi)標(biāo)法。臨床檢驗(yàn)工作中前兩種應(yīng)用較多，而且測定血液或血清中鈉和鉀已成常規(guī)。應(yīng)用火焰光度法測定某些元素的波長及檢測限見表16-4。

表16-4 火焰光度法測定某些元素的波長與檢測限

（三)散射光譜分析法

散射光譜分析法主要測定光線通過溶液混懸顆粒后的光吸收或光散射程度的一類定量方法。測定過程與比色法類同，常用法為比濁法。但顆粒的大小和形狀及懸液的穩(wěn)定性對比濁結(jié)果有較大的影響，因此不能完全按比色法的規(guī)律進(jìn)行測定，否則就會引起誤差。

1、儀器和測定方法　由于測定儀器和方法的不同，比濁法又可分為散射測渾法（turbidimetry)和濁度測定法（nephelometry)二類。前者利用一般的光電比色計和分光光度計，其原理是利用光線通過混懸溶液時，由于顆粒的散射使通過的光線減弱，根據(jù)光線減弱的程度測定溶液中顆粒的濃度，所以，實(shí)際上可將散射測渾法看成是比色分析的一種特殊情況。后者則是直接測定混懸溶液中顆粒散射光的強(qiáng)度，由于一般光電比色計中光源和光電管在一直線上，無法測定散射光線的強(qiáng)度，需要特殊的濁度計，如激光比濁儀。測定方法可采用速率法或終點(diǎn)法進(jìn)行。

速率散射比濁法是一種動力學(xué)測定方法，1977年由Seternbery首先用于免疫測定，在一定條件下，抗原和相應(yīng)的抗體很快結(jié)合成抗原抗體免疫復(fù)合物顆粒，速率比濁法就是在一定時間內(nèi)抗原抗體結(jié)合過程中，測定二者結(jié)合的最大反應(yīng)速度，即反應(yīng)達(dá)頂峰峰值。終點(diǎn)散射比濁法用于免疫測定時，在一定時間內(nèi)，通常是抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，復(fù)合物的濁度不再受時間的影響，但必須在聚合形成絮狀沉淀之前進(jìn)行濁度測定。

2、影響比濁法測定的因素比濁法的突出問題是顆粒的大小對濁度和濁度曲線有較大的影響。因此，在比濁法中必須力求作到：①混懸液中微粒的分散度也就是顆粒的大小應(yīng)盡可能相同，并易重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)管和測定管中顆粒大小應(yīng)力求一致。②混懸液在一定時間內(nèi)，至少10分鐘內(nèi)應(yīng)維持穩(wěn)定，也就是顆粒應(yīng)該不易相互聚集，變粗變大。為此，關(guān)鍵在于制備混懸液必須嚴(yán)格控制條件，一般應(yīng)注意；①沉淀劑或抗體的濃度，一般情況下濁度隨其濃度的增高而增大。②混勻方法和速度，一般而言，緩慢加入試劑，逐滴加入，不斷搖勻，易產(chǎn)生粗顆粒沉淀；而迅速加入，迅速搖勻，易產(chǎn)生膠態(tài)溶液。③溫度，溫度升高可加快分子間的碰撞，常使某些在室溫細(xì)小均勻的顆粒易變?yōu)榇执蟮男鯛畛恋�。④pH溶液，pH可影響沉淀的形成及顆粒的大小，如蛋白質(zhì)、酶類，在其等電點(diǎn)pH值時最易形成顆粒并沉淀。⑤混懸液的穩(wěn)定性和測定時間，大多數(shù)混懸液隨放置時間的延長顆粒變粗而沉淀，吸光度下降，因此應(yīng)及時比濁。如出現(xiàn)沉淀太快，可以加入保護(hù)性膠體，如聚乙烯吡咯烷酮、表面活性劑等，但應(yīng)注意加入后可能會引起顆粒及光學(xué)性質(zhì)的變化。⑥其它電解質(zhì)和非電解質(zhì)存在的干擾。由此可見，比濁法易受外界各種因素的影響，因此在建立一種比濁測定方法時，必須認(rèn)真探索其反應(yīng)規(guī)律，力求控制各種影響因素以克服比濁法重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差的缺點(diǎn)。

3、比濁法的應(yīng)用目前在臨床生化檢驗(yàn)中使用最多的比濁法是免疫比濁法，如免疫球蛋白、載脂蛋白和補(bǔ)體等項(xiàng)目均已大部分用免疫比濁法進(jìn)行快速定量。

早在1838年Libby等人把比濁法測定就應(yīng)用到抗原抗體反應(yīng)上。所謂免疫比濁法是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過測定復(fù)合物形成量的多少，對抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。在介質(zhì)溶液中形成復(fù)合物需要一定的條件，包括：①要有特異性抗體。作為組織或體液中蛋白質(zhì)種類相當(dāng)多，若要快速特異測定，就需要有單價特異抗體，也就是說，某一種蛋白有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再定量。若抗體不純或混有另一種或兩種少量抗體，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴，結(jié)果偏高。②抗原抗體的比例要適當(dāng)。因免疫復(fù)合物的形成有三個階段，第一階段是初步形成抗原抗體二元復(fù)合物；第二階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價時即無過�？贵w，此時，復(fù)合物的結(jié)合和解離處在平衡狀態(tài)，其混濁程度達(dá)高峰，在抗體過量時，隨抗原量的增加而復(fù)合物的形成也增加，成正比關(guān)系，其測定只能在以應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行。同時，抗原也不能過量，因?yàn)榭乖�過量，則復(fù)合物減少，光散射或光吸收就減少，檢測結(jié)果偏低。③溶液介質(zhì)適宜，一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合的形成，如聚乙二醇6000等，溶液pH以6.5～8.0之間為宜，離子強(qiáng)度大比小易形成復(fù)合物，對離子的種類也有一定的要求。

在免疫比濁過程中，由于抗原與抗體結(jié)合有三個階段，從而導(dǎo)致吸光度與濃度之間不呈線性關(guān)系，一般是三次方程曲線關(guān)系。如果要將抗原與抗體兩個變量之間的變動特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜�，需要�?jīng)三次方程擬合成近似直線化的曲線方程，再進(jìn)行運(yùn)算。方法可采用終點(diǎn)法和速率法，用五個不同濃度進(jìn)行定標(biāo)，經(jīng)三次曲線方程求出一條能反映真實(shí)情況的濃度與吸光度的關(guān)系曲線方程。作為定量的工作曲線。

三、影響光譜分析的主要因素

光譜分析的基礎(chǔ)是被測物質(zhì)的濃度與吸亮度成正比，但在實(shí)際測定中，往往容易發(fā)生偏離直線的現(xiàn)象而引入誤差，導(dǎo)致誤差的主要原因有化學(xué)因素、主觀因素和光學(xué)因素等三類。

（一)化學(xué)因素

化學(xué)因素是指被測溶液不遵守光吸收定律所引起的誤差。主要有以下幾種影響。

1、被測物濃度的影響由于有色物質(zhì)的電離、水解、締合等原因，當(dāng)溶液稀釋或增濃時，有色物質(zhì)顏色的深淺并不按比例降低或增高，因而也就不完全符合光吸收定律。

2、溶液pH的影響 有些溶液的顏色對pH值的改變十分敏感，因而溶液pH不同時常會產(chǎn)生誤差，如溴甲酚綠法測定血清白蛋白。

3、雜質(zhì)的影響如被測物溶液中含有雜質(zhì)而且這種雜質(zhì)本身是有色的，或能和顯色劑生成有色化合物或沉淀，或能與被測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，都會影響吸光度的變化。

4、放置時間的影響某些有色物質(zhì)能迅速生成，但卻不太穩(wěn)定，放置后色澤消退或起變化，而另一些有色物質(zhì)須經(jīng)過相當(dāng)長的時間后，反應(yīng)才能完全，因此，若在不恰當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)進(jìn)行比色，將會造成相當(dāng)大的誤差。

此外，還有溶劑、溫度、溶液體系的均勻性等都會引起測定的誤差。

（二)主觀因素

由于操作不當(dāng)，特別是在分離、稀釋和加顯色劑等過程中，沒有遵守一定的條件，也會引入不同程度的誤差。因?yàn)橛行┯猩�物質(zhì)的生成和其顏色的深淺，往往隨加入試劑的量、加入順序、試劑濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等因素而發(fā)生改變。

（三)光學(xué)因素

光學(xué)因素主要是指分析儀器的性能低劣所引起的誤差，分析儀器應(yīng)用最多的是分光光度計，它們的性能好壞直接影響到測定結(jié)果的可靠性和精密性。因此對分析儀器均應(yīng)有質(zhì)量保證措施，這里主要介紹分光光度的質(zhì)量保證方法。

1、分光光度計的性能檢查

（1)波長校正：使用光電比色計或分光光度計，在更換光源燈、重新安裝、搬運(yùn)或檢修后，以及儀器工作不正常時，都要進(jìn)行波長校正。就是正常工作的儀器，每隔一個月也要檢查一次波長，必要時進(jìn)行校正，這樣才能保證波長讀數(shù)與通過樣品的波長符合，保證儀器的最大靈敏度。方法常用譜釹濾光片校正法，適用于721型儀可見光區(qū)的波長校正，常以585nm或529nm處的吸收峰或T%為標(biāo)準(zhǔn)。鑒于721型儀器的出射光波長較寬，不易將573nm和585nm的兩峰或兩谷分開，校正時易產(chǎn)生誤差，故推薦用529nm處的峰或谷為標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行波長校正。校正時，將儀器按要求預(yù)熱。要求電源電壓穩(wěn)定。波長度盤置580nm處，T%調(diào)至最大，在比色杯處放一白紙條，觀察是否有光強(qiáng)均勻、邊緣無光暈或雜光的光斑，如不符合要求，可調(diào)節(jié)燈泡位置使其符合要求，是為波長校正的粗調(diào)。再把靈敏度扭置于“1”（最低檔)，波長度盤對準(zhǔn)529nm，電表機(jī)械零點(diǎn)為零，在光路空白時調(diào)T%為100%T，并反復(fù)查零點(diǎn)和100%T穩(wěn)定情況。將譜釹濾光片插入光路，慢慢旋轉(zhuǎn)波長度盤，找到透光率最低的一點(diǎn)（向左右微旋波長度盤時，該點(diǎn)透光率值均增加)，這一點(diǎn)即為波長529nm。檢查波長度盤的指示值是不是529nm，如指示值為534nm，此時波長工誤差為5nm，超出規(guī)定（±1nm)必須進(jìn)行調(diào)整。

調(diào)整方法：將波長度盤對準(zhǔn)529nm，從光路取出譜釹濾光片，光路空白時調(diào)電表指針到100%T，再將譜釹濾光片插入光路。打開儀器左側(cè)小蓋板，找到波長校正螺絲（3個中左側(cè)柄長的一個)；反時針方向微微調(diào)節(jié)（負(fù)誤差時順時針方向)，使電表指針的指示T%為最低。反復(fù)檢查波長誤差情況，直到符合儀器技術(shù)指標(biāo)為止。蓋好左側(cè)小蓋板，校正結(jié)束。

有些高檔儀器如島津UV-260型雙光束分光光度計，可使用氫燈或置譜釹濾光片于測定比色槽內(nèi)，編入濾工掃描程序后，儀器即可自動地在一定波長范圍內(nèi)進(jìn)行波長校正。高檔分光光度儀的光學(xué)系統(tǒng)密封在一個單元組件內(nèi)，若發(fā)生故障，波長不準(zhǔn)，常須請制造商派專人修理。其它尚有譜線校正法、干涉濾光片校正法和有色溶液校正法等，可參考有關(guān)資料。

（2)線性檢查：線性檢查包括儀器線性及測定方法線性兩個方面的檢查。線性誤差表現(xiàn)為溶液的濃度與吸光度不成線性關(guān)系，出現(xiàn)正偏離或負(fù)偏離的現(xiàn)象。這種偏離，按比耳定律的現(xiàn)象來自兩個方面：一是溶液本身不符合比耳定律，這種現(xiàn)象叫做化學(xué)偏離；二是儀器本身各種因素的影響，使吸光度測定值與濃度之間不成線性關(guān)系，這種現(xiàn)象叫儀器偏離。此處研究的是后者。儀器偏離的因素很多，如雜光、有限帶寬、檢測器噪聲、環(huán)境條件變化、波長的變動、比色杯的誤差、輻射光的非平行性、檢測器本身的非線性等。

儀器線性檢查常用一種在一定波長及一定濃度范圍內(nèi)確知其服從比耳定律的有色物質(zhì)，配成不同濃度的溶液，來檢查儀器本身是否能如實(shí)地反映有色物質(zhì)的濃度變化。這種檢查方法與任何被測物質(zhì)呈色反應(yīng)等方法學(xué)上的問題無關(guān)。用測得的吸光度對濃度作圖，在理想情況下應(yīng)是一條直線。常用的方法是用0.8、1.6、2.4、4.0mg/L伊文藍(lán)濃度系列來檢查，波長用610nm。

（3)雜光（散光)檢查：在吸光度測定中，凡檢測器感受到的不需要的輻射都稱為雜光。雜光對吸光度測定法的準(zhǔn)確性有嚴(yán)重的影響，但卻往往被忽視。雜光的來源有：①儀器本身的原因，如單色器的設(shè)計、光源的光譜分布、光學(xué)原件的老化程度、波帶寬度以及儀器內(nèi)部的反射及散射等；②室內(nèi)光線過強(qiáng)而漏入儀器，儀器暗室蓋不嚴(yán)；③樣品本身的原因，如樣品有無熒光、樣品的散射能力強(qiáng)弱等。

雜光檢測方法：①紫外光區(qū)的雜光監(jiān)測可用10±0.1g/L的碘化鈉溶液，在240nm處測定的吸光度應(yīng)大于2.00。此外，也可用12g/L的氯化鉀溶液，在220nm處測其透光度，即為雜光量，一般應(yīng)小于1%T。以上測定均用石英杯，以蒸餾水校零。②在可見光區(qū)可使用譜釹濾光片或硫酸鎳法檢查。先用譜釹濾片校正波長，然后用黑紙片擋住比色杯光路（進(jìn)口儀器帶有比色杯樣黑色標(biāo)柱)之后調(diào)整0%T，再用空氣做空白調(diào)100%T。插入譜釹濾光片，在585nm處測定，其測定值即為雜光水平。

（4)比色杯的質(zhì)量檢查：比色杯一般由玻璃、石英或熒石制成，光徑1.0或0.5cm,光線通過時有一部分光為空氣與玻璃接觸面的反射而損失（4%)，另一部分（很少)為玻璃吸收。比色杯的質(zhì)量除其原料外，再就是玻璃的厚度均勻，上下一致，各杯彼此相配。廠家多以四個一套供應(yīng)，且杯口上部外面標(biāo)有箭頭，箭頭對光源側(cè)使用。盡管如此，在使用前還是應(yīng)作質(zhì)量檢查。常用伊文藍(lán)法：將一定量的2.0mg/L的伊文藍(lán)溶液注入比色杯中，比色杯內(nèi)液面應(yīng)相等。用一個比色杯作標(biāo)準(zhǔn)，用紅色濾光片（波長600～610nm)，用水校零后將此杯的讀數(shù)準(zhǔn)確調(diào)至50%T，接著讀取其余杯的透光度。透光度相差在±0.5%T范圍內(nèi)者為合格。

（5)穩(wěn)定性檢查：檢查方法：將分光光度計及附件接于0.5kVA以上的可調(diào)變壓器，先調(diào)電壓為220V，波長固定在650nm，在光路比色杯裝以空白液，調(diào)讀數(shù)為90%T處，再將電壓升至230V及降至190V，觀察透光度的漂移值。若介于88.5%～91.5%T之間為合格。在電源電壓不變的條件下，在3分鐘內(nèi)其讀數(shù)漂移不應(yīng)超過標(biāo)尺上限值的±0.5%。

（6)重復(fù)性檢查：在波長、工作狀態(tài)、電源電壓、比色杯配套等合格的前提下，進(jìn)行重復(fù)檢查。在用交流電源供電時，儀器對一種溶液重復(fù)測定的讀數(shù)值差應(yīng)小于或等于標(biāo)尺上限值的1%。試驗(yàn)方法：將分析純重絡(luò)酸鉀于120～150攝氏度烘干2小時，干燥器中冷卻。精稱509.1mg于1000ml容量瓶中，以蒸餾水溶解并加至刻度，混勻（此液180mg/L鉻)。就用液為30、60、180mg鉻/L。取波長440nm，將應(yīng)用液各濃度管連續(xù)測3～5次，各濃度管中最大誤差小于1%T為合格。

（7)靈敏度檢查：將重鉻酸鉀液配制成30和32.5mg鉻/L及120和122.5mg/L鉻的4種應(yīng)用液（濃度差兩組各為2.5mg/L鉻)。波長440nm，以水校零點(diǎn)，將上述應(yīng)用液連續(xù)測3次吸光度，兩組2.5mg/L鉻濃度差的吸光度值差都不小于0.01為合格。

2、分光光度計日常工作狀態(tài)監(jiān)測在可見光區(qū)范圍內(nèi)，用一種有色溶液檢查儀器是否處于較好的工作狀態(tài)（包括波長、雜光水平等)，常用硫酸鎳水溶液。該液在400～700nm之間有吸收峰，峰值在510nm。檢查時，在400、460、510、550及570nm處測定硫酸鎳溶液的透光度值，記錄并保存。待一定時間后用該溶液再檢測。比較前后兩次的數(shù)據(jù)，即可知儀器的工作狀態(tài)。

硫酸鎳溶液的制備：將硫酸鎳溶于0.1%的硫酸中，用量的多少以在510nm測得的透光度達(dá)80%T為準(zhǔn)，以0.1%硫酸校零點(diǎn)，配好后密封備用。

監(jiān)測的意義：在400、700nm處的測定可以監(jiān)測雜光，這些波長處的測定值升高說明雜光增加，其中任一值增加3%就需要進(jìn)行檢修。510nm處的測定值可以監(jiān)測帶寬，這個波長的測定值減小說明帶寬加大。光源強(qiáng)度減弱或波長不準(zhǔn)可以產(chǎn)生這種結(jié)果，如降低2%T，對于帶寬為20nm的儀器就需要修理。460與550nm處的讀數(shù)主要作為監(jiān)測波長之用，稱二次波長校正。這兩個波長的讀數(shù)相互關(guān)聯(lián)，一個升高另一個就降低。如460nm的測定值（透光度)降低，而550nm的測定值升高，說明透過比色杯樣品的波長小于波長度盤指示的波長（圖16-2左)。反之，如460nm的測定值升高，而550的測定值降低，說明透過比色杯樣品的波長大于波長度盤指示的波長（圖16-2右)。

圖16-2 硫酸鎳溶液監(jiān)測儀器工作狀態(tài)

實(shí)線代表波長正確時的吸收光譜，虛線代表波長不正確時的吸收光譜。箭頭１表示510nm處的透光度，左右圖均下降；箭頭2表示460nm處的透光度，左圖下降，右圖升高，箭頭3表示550處的透光度，左圖升高，右圖下降。

儀器工作狀態(tài)測定后，若波長與雜光符合要求時，記錄并保存各項(xiàng)數(shù)據(jù)，以備以后測定時對比。一般應(yīng)每月監(jiān)測一次，當(dāng)400nm及700nm處雜光增強(qiáng)時，可能的原因包括：①激發(fā)光源陳舊，變黑或表層模糊不清。②透鏡有灰塵。③色散元件失效等。如510nm處透光度減弱，可能原因?yàn)楣庠礋艚z故障，比色池出光縫失靈或光柵損壞。