細胞因子在機體免疫應答過程中起著十分重要的作用。在某些疾病時，體內(nèi)細胞因子及其受體表達可發(fā)生異常，與機體免疫功能低下或發(fā)生病理損傷有關。因此，在臨床免疫學中越來越重視對細胞因子及其受體的檢測。在基礎免疫研究中，常需檢測不同條件培養(yǎng)液中細胞因子的活性，并探討細胞因子產(chǎn)生水平與免疫細胞表型、增殖、殺傷及其它功能的關系。此外，原核細胞和真核細胞中表達的重組細胞因子或經(jīng)過不同工藝純化后的產(chǎn)品需測定其活性和含量。
從細胞因子及其受體檢測的水平來說，可以分為基因組DNA、mRNA和蛋白三個不同的水平，后者又包括胞漿內(nèi)、膜表面以及分泌到體液或培養(yǎng)上清等三種不同形式細胞因子。目前應用最多的是檢測體液或培養(yǎng)豐清中的細胞因子以及膜表面的細胞因子受體。
細胞因子生物學活性檢測法是根據(jù)某些細胞因子特定的生物學活性，應用相應的指示系統(tǒng)和標準品來反映待測標本中某種細胞因子的活性水平，一般以活性單位來表示。生物學檢測法一般敏感性較高，直接表示待測標本中的活性水平。但實驗周期較長，如集落形成法需10～14；易受細胞培養(yǎng)中某些因素的影響，如血清、pH、藥物；易受生物學活性相同或相近的其它細胞因子的影響，如檢測IL-2時可受IL-4的干擾，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素)表現(xiàn)出極為相似的生物學作用；易受待栓樣品中某些細胞因子抑制物的干擾，如IL-1活性可被IL-1受體拮抗物（IL-1ra)所抑制，TNF-α可被TNF-BP所阻斷；不能區(qū)分某些細胞因子的型和亞型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亞型顯示相同的生物學活性；某些指示細胞長期培養(yǎng)易發(fā)生突變；不同指示細胞對同一種細胞因子的敏感性不同，所慕名而來結(jié)果難于標準化；此外，某些人源的細胞因子如hIL-2對小鼠細胞起作用，但鼠源性的IL-2對人的細胞則無刺激作用。
生物學檢測的方法大致可分為增殖或增殖抑制、集落形成、直接殺傷靶細胞、保護靶細胞免受病毒攻擊、趨化作用以及抗體形成法等幾類。
（一)增殖或增殖抑制法
其基本52667788.cn/rencai/原理是應用某一細胞因子能特異地刺激或抑制某些指示細胞的增殖，通過3H-TbR摻入或MTT法顯色，反映待檢細胞因子的活性水平。
（二)集落形成法
其基本原理是應用骨髓干細胞體外半固體培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)不同造血因子能誘導干細胞或定向造血祖細胞形成某一種或某些種類細胞的集落，通過對形成集落形態(tài)學、酶學鑒定，計算不同種類集落形成的數(shù)量和比例，反映待測標本中CSF的種類和活性水平。
（三)直接殺傷靶細胞
在細胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接殺傷某些腫瘤細胞的作用，采用TNF敏感的細胞株如小鼠成纖維細胞株L929，以及WEHI164亞克隆13作為指示細胞，通過3H-TdR釋放法或染料染色等可檢測待檢樣品中TNF的活性水平。
（四)保護靶細胞免受病毒的攻擊
靶細胞受某些病毒感染后可發(fā)生明顯病變和死亡，干擾素可保護靶細胞免受病毒的攻擊，常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV),敏感的指示細胞為喉癌的上皮細胞株Hep2和羊膜的上皮細胞WISH，通過干擾素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ)抑制病毒致病變的程度，計算出待測樣品中IFN的活性單位。
（五)趨化作用
IL-8對多形核細胞、淋巴細胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂趨化法，PMN或淋巴細胞作為指示細胞，以細胞趨化的程度來反映樣品中IL-8活性水平。
（六)抗體形成法
IL-6可在體外刺激某些B淋巴細胞系產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白，常用的指示細胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的條件下，待檢樣品中IL-6水平與培養(yǎng)細胞上清IgG或IgM水平正相關，通過標準IL-6的對照可推算出待檢樣品中IL-6的活性。
表4-22 細胞因子生物學活性檢測方法（舉例)
| 被檢細胞因子 | 實驗系統(tǒng) | 可干擾的52667788.cn/Article/因素 | |
| IL-1 | D.10（小鼠T細胞) | 增殖法（3H-TdR、MTT) | 人IL-2；小鼠IL-2、IL-4、IL-7、GM-CSF、TNF等 |
| 小鼠胸腺細胞 | 增殖法 | TGF-β1、β2抑制作用 | |
| IL-4（小鼠胸腺瘤) | CTLL轉(zhuǎn)換法（增殖法) | 小鼠IL-4 | |
| 黑素瘤細胞A352 | 增殖抑制法 | ||
| IL-2 | CTLL（小鼠殺傷性T細胞系) | 增殖法 | 小鼠IL-4 |
| IL-3 | KG1（髓樣白血病細胞) | 增殖法 | |
| TF-1（前髓樣細胞) | 增殖法 | EPO、IL-5、IL-6、GM-CSF | |
| 小鼠造血細胞系FDCP-1 | 增殖法 | GM-CSF | |
| 人巨核母細胞白血病細胞系Mo7E | 增殖法 | GM-CSF、IL-9 | |
| 骨髓半固體造血祖細胞集落形成 | 20α類固醇脫氫酶 | GM-CSF | |
| 集落種類和數(shù)量 | GM-CSF、IL-1、IL-6、G-CSF、M-CSF | ||
| IL-4 | 小鼠B細胞 | 誘導CD23、MHCⅡ類 | IFN-γ有抑制作用 |
| 抗原表達 | |||
| PHA刺激的小鼠T細胞 | 增殖法 | IL-2 | |
| IL-4依賴細胞株 | 增殖法 | IL-2 | |
| 人IL-4R轉(zhuǎn)染CTLL | 增殖法 | IL-2 |
續(xù)表1
| 被檢細胞因子 | 實驗系統(tǒng) | 可干擾的因素 | |
| IL-5 | 抗Ig（或SAC)刺激B細胞誘導人或小鼠骨髓半固體培養(yǎng)中嗜酸性粒細胞成熟 | 增殖法 | IL-3 |
| 抗Ig處理的小鼠B細胞 | IgM分泌 | ||
| BCL-1（B淋巴瘤細胞) | 增殖法 | IL-4 | |
| IL-6 | TF-1（前髓樣細胞) | 增殖法 | EPO、IL-3、IL-5、GM-CSF |
| B9（小鼠雜交瘤細胞) | 增殖法 | 小鼠IL-4、IL-11 | |
| 7TD1（小鼠雜交瘤細胞) | 增殖法 | IL-11 | |
| BM60 | 增殖法 | ||
| HepG2（肝細胞) | Fibronogen產(chǎn)生 | LIF | |
| CESS（EBV轉(zhuǎn)化人B細胞) | IgGβ1、TGF-β2有抑制作用 | ||
| DKW6.CL-4 | IgM產(chǎn)生 | TGFβ1、TGF-β2有抑制作用 | |
| IL-7 | 骨髓前B細胞 | 增殖法 | |
| IL-8 | 中性粒細胞 | 軟瓊脂趨化法 | 其它化學趨化物質(zhì) |
| 小室趨化法 | G-CSF、M-CSF | ||
| IL-9 | Mo7E（巨核細胞白血病系) | 增殖法 | IL-3、GM-CSF |
| IL-11 | 7TD1（小鼠雜交瘤細胞系) | 增殖法 | IL-6 |
| B9（小鼠雜交瘤細胞系) | 增殖法 | 小鼠IL-4、IL-6 | |
| T1165 | 增殖法 | IL-6 | |
| IL-12 | PBMC | IFN-γ產(chǎn)生 | IFNα/β/γ |
| PHA活化T淋巴母細胞 | 增殖法 | IL-2、IL-4 | |
| PBL | LAK殺傷（與IL-2協(xié)同) | IL-2、IL-6 | |
| 骨髓祖細胞 | GM集落形成 | IL-3；TGF-β有抑制作用 | |
| TF-1（前髓樣細胞) | 增殖法 | EPO、IL-3、IL-5、IL-6 | |
| 小鼠造血細胞FDCP-1 | 增殖法 | IL-3 | |
| 人巨核母細胞白血病細胞系Mo7E | 增殖法 | IL-3、IL-9 | |
| AML-193 | 增殖法 | ||
| 造血祖細胞 | 粒細胞集落形成 | IL-3、IL-9 | |
| 中性粒細胞 | 活化后超氧釋放 | GM-CSF | |
| WEHI164亞克隆13或L929 | 殺傷作用 | GM-CSF、IL-6 | |
| TNF-α和TNF-β（LT)有相似的殺傷作用 |
續(xù)表2
| 被檢細胞因子 | 實驗系統(tǒng) | 可干擾的因素 | |
| PDGF | 成纖維細胞和SS、WHG、WI26、WI28 | 增殖法 | FGF（1、2、5)、EGF、TGF-β、IL-1、TNF等 |
| INF-α/β/γ | 上皮細胞如Hep-2、Wish | 抵抗病毒（如VSV)的致病變作用 | FN-α/β/γ有相似的生物學活性 |
| TGF-β | 成纖維細胞（半固體培養(yǎng)) | 增殖法 | |
| 成骨細胞單層培養(yǎng) | 增殖法 | ||
| PHA刺激PBMC | 增殖抑制法 | ||
| ConA/IL-1誘導胸腺細胞 | 增殖抑制法 | IL-2、IL-4 | |
| 人黑素瘤細胞A375 | 增殖抵制法 | IL-1、IL-2、IL-4 |
免疫學檢測法的基本原理是細胞因子（或受體)與相應的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通過同位素、熒光或酶等標記技術加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細胞因子（或受體)的水平。這類方法的優(yōu)點是實驗周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干擾，如抗體的特異性高可區(qū)分不同型或亞型的細胞因子（如IFN)，一次能檢測大量標本，易標準化。與生物學活性檢測方法相比，免疫學檢測法在許多情況下敏感性低于前者，所得結(jié)果不表示生物學活性，有的McAb只能識別重組的細胞因子，在檢測天然的細胞因子中受到限制。
免疫學檢測的方法多采用ELISA和RIA法，可以分為平心法、競爭法和間接法。
根據(jù)抗體性質(zhì)和特異性不同可有以下幾種不同的平心法ILISA。
1.PcAb與McAb夾心法 用純化的多克隆抗體（PcAb)包被板子，加待檢細胞因子（或可溶性受體)和標準品，上層加酶標記的McAb。有時為了增加敏感性，上層加McAb后再用酶標記第二抗體顯色。
2.McAb與PcAb夾心法 用McAb包被板子，加待檢樣品，上層加酶標記的PcAb。有時為了增加敏感性，上層加PcAb后再用釗對PcAb的酶標記抗抗體。
3.雙McAb夾心法 選擇和應用識別同一個細胞因子（或受體)分子上不同表位的兩種McAb，其中一種包被板子，另一種McAb標記酶。由于單克隆抗體親和力識別表位地勻一，從質(zhì)量控制角度來看，一般比上兩種夾心法易控制。如目前已商品化檢測細胞因子（或其受體)的檢測盒大多采用雙單克隆抗體夾心法。
4.細胞、McAb夾心法 用表達IL-2R的MT-1細胞包被板子，加入待檢IL-2或標準品，上層加125I標記的McAb，根據(jù)γ計數(shù)cpm值推算出待檢IL-2含量。
有報道用況爭法檢測IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子，同時加入125I標記的IL-2和待測IL-2，根據(jù)γ計數(shù)cpm值得知待檢IL-2對125I-IL-2與PcAb競爭結(jié)合的程度，從而推算出待測標本IL-2的含量。這種方法檢測IL-2的敏感性可達50pg/ml。
為了增加敏感性，在上述系統(tǒng)中可再連接上生物素，再用鏈霉親和素（streptavidin)酶標記物進行放大。此外，還可用化學發(fā)光、改進顯色底物等措施提高檢測方法的敏感性。
表4-23 細胞因子生物學活性與免疫學檢測方法的比較
| 生物學活性法 | 免疫學檢測法 | |
| 原理 | 細胞因子特定的 | 細胞因子與相應抗體 |
| 生物學活性 | 特異性結(jié)合反應 | |
| 結(jié)果表示 | 生物學活性水平 | 含 量 |
| 敏感性 | 一般較高 | 一般較低 |
| （與細胞表面高親和力受體有關) | （加放大系統(tǒng)可明顯升高) | |
| 特異性 | 低 | 高 |
| （識別類型、亞型) | （不能) | （不可能) |
| 周 期 | 較 長 | 短 |
| 受實驗條件影響 | ||
| 培養(yǎng)條件 | 大 | 小 |
| 指示細胞敏感性差異 | 大 | ／ |
| 指示細胞突變 | 可發(fā)生 | ／ |
| 生物學作用相同因子干擾 | 大 | 小 |
| 樣品中特異性或非特異性 | 大 | 小 |
| 抑制物干擾 | ||
| 重復性 | 較 差 | 較 好 |
| 標準化、大量檢測 | 困 難 | 容 易 |
許多細胞因子產(chǎn)生過程中，有一個胞漿到胞膜，再釋放到體液或培養(yǎng)上清中的動態(tài)變化。一般可采用免疫組織化學染色技術或免疫熒光技術檢測細胞或組織切片中細胞因子（或受體)定位（胞漿、胞膜)，產(chǎn)生細胞的頻數(shù)，以及胞漿、胞膜、上清中濃度改變的動態(tài)變化。目前已報道IL-2、TNF-α、IFN-γ等細胞因子以及幾科所有細胞因子的受體可用這類方法進行檢測。流式細胞儀（FCM)與間接免疫熒光法相結(jié)合檢測細胞膜表面細胞因子受體，可獲得客觀正確的結(jié)果。用同位素標記配體或標記抗細胞因子受體的抗體，進行競爭結(jié)合試驗，可檢測細胞因子受體表達的數(shù)量以及親和力大小。
通過核酸標記技術可將細胞因子cDNA作為基因探釗檢測細胞內(nèi)細胞因子基因組DNA或mRNA。主要有以下幾種方法：
1.應用同位素（或非同位素)標記的cDNA探針，檢測經(jīng)Northernblot后細胞因子mRNA水平或采用打點雜交法。
2.應用標記cDNA探釗與細胞或組織切片進行原位雜交，然后進行放射自顯影。
3.細胞因子mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細胞因子引物經(jīng)聚合酶鏈反應（PCR)擴增細胞因子cDNA,Southern blot后用標記探針檢測特異細胞因子DNA水平。
（金伯泉)
