放射性同位素標(biāo)記核酸探針

　　三、應(yīng)用特異單引物法標(biāo)記DNA探針

　　應(yīng)用探針DNA上的一個(gè)片段作為DNA引物，以環(huán)化探針DNA的重組質(zhì)粒DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)變性，退火和延伸過(guò)程，使探針DNA得到標(biāo)記。反應(yīng)在0.5ml離心管內(nèi)進(jìn)行，總體積為25μl，內(nèi)含50mmol/l Tris—HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl₂、BSa 5mmol/L、80ng引物DNA和0.1μg連接的DNA或0.1μg質(zhì)粒。反應(yīng)管在95℃變性5min，取出，稍離心，立即放入37℃C水浴保溫2min使DNA退火，加入1UE.coli DNA聚合酶I，在37℃進(jìn)行延伸反應(yīng)。對(duì)環(huán)化基因，延伸18min，對(duì)質(zhì)粒DNA延伸35min重復(fù)上述變性、退火和延伸過(guò)程1次。

　　四、雙引物法標(biāo)記DNA探針?lè)?/P>

　　反應(yīng)在0.5ml管內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)體積為50μl，內(nèi)含50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg－Cl₂、10mmol/L β-巰基乙醇和500μg BSA/ml，引物片段1和2各90ng，模板DNA0.1μg,[α-³²P]dCTp 1.5×10⁶Bq，dATp 、dGTP和dTTP各200μmol/L。標(biāo)記反應(yīng)包括3個(gè)步驟：

　�。�1)變性：反應(yīng)管在95℃水浴5min，然后離心；

　�。�2)退火：37℃水浴2min；

　�。�3)延伸：加入DNA聚合酶i 1u，37℃水浴18min。重復(fù)上述變性、退火、延伸過(guò)程1～2次，分別進(jìn)行其標(biāo)記率測(cè)定：取0.5μl反應(yīng)液分別點(diǎn)于兩張濾紙片上，烤干。一張經(jīng)0.6mol/L三氯醋酸（TCA)、0.3mol/l TCA依次洗滌，每次10min，然后再用無(wú)水乙醇，醇醚混合液和乙醚洗滌各5min。兩張濾紙分別放入閃爍瓶?jī)?nèi)，測(cè)定cpm值，達(dá)到10⁸cpm/μg DNA以上。

　　五、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)標(biāo)記高活性DNA探針

　　在0.5ml離心管內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)總體積為50μl，內(nèi)含模板DNA350ng,DNA引物各50pmol/L,dGTP、dCTP和dTTP各200μmol/L，[α-³²P]dATp 1.1×10⁶Bq，反應(yīng)緩沖液為67mmol/l Tris—HCl pH8.8含2.5mmol/l MgCl₂、6.7mmol/L(NH₄)₂SO₄、10mmol/l β-巰基乙醇、170mg/l BSA、6.7μmol/l EDTA和40μl/ml二甲亞砜。將反應(yīng)管置于95℃水浴變性5min取出，加入Taq DNA聚合酶0.5～2u,在旋渦混合器上混勻簡(jiǎn)單離心一下，加入35μl石蠟油。放入65℃水浴2min，取出，立即進(jìn)入PCR循環(huán)：91℃變性30s,51^。C退火1min，68℃延伸2min。重復(fù)上述過(guò)程15次。最后將反應(yīng)管置65℃水浴5min。反應(yīng)完成，加入酵母tRNA10μg。分別測(cè)定參入和游離放射性計(jì)數(shù)，參入率為97.4%。標(biāo)記DNA探針經(jīng)醋酸鈉酒精沉淀回收。將沉淀溶于10mmol/l Tris—HCl 、EDTA(pH8.0)100μl。用PCR方法標(biāo)記的DNA探針特異性高，敏感性好，可測(cè)出的最低靶DNA量為10fg,利用PCR還可以作DNA探針的非放射性標(biāo)記。

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