自Gall和Pardue建立了原位雜交技術(shù)以來近20余年內(nèi)，這一技術(shù)為基因的定位和表達(dá)、基因進(jìn)化、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和遺傳分析等領(lǐng)域研究提供了極其寶貴的資料，發(fā)揮了其它技術(shù)難以取代的作用。近年來，此一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大并在兩個主要進(jìn)行了技術(shù)法的改進(jìn)。一方面是應(yīng)用一系列放大手段增強(qiáng)檢測的靈敏度（詳見二十二章 )，另一方面是提高其分辨率，即向電鏡水平發(fā)展。Jacob（1971)首先用3H標(biāo)記的核酸RNA探針與DNA雜交并在電鏡水平顯示獲得成功，繼后不少科技工作者在這方面做了大量的工作（Manning et al 1975,Steinert et al 1976,Hutchison et al 1982)。但所應(yīng)用的均是同位素標(biāo)記核酸探針，直到1986年Binder首先用生物素標(biāo)記的rDNA及UI探針，在蜂蠅（Drosophila)卵巢，應(yīng)用Lowicryl-K4M低溫包埋的切片上進(jìn)行原位分子雜交，以蛋白A和膠體金復(fù)合物作為顯示系統(tǒng)，較好的保存了組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和較高的信噪比例。Webster等人（1986)應(yīng)用生物素標(biāo)記探針顯示了細(xì)胞內(nèi)mRNA的分布。Singer等（1989)成功的用雙標(biāo)記原位雜交技術(shù)，一方面檢測整裝抽提細(xì)胞內(nèi)與骨架結(jié)合的mRNA，同時顯示了該mRNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)。新近Fischer等利用地高辛標(biāo)記rRNA探針在Lowicryl-K4M包埋的切片進(jìn)行雜交，然后以抗地高辛等抗體結(jié)合膠體金顆粒進(jìn)行顯示，以銀顯示法加強(qiáng)獲得極為滿意的定位�？傊婄R水平的原位分子雜交技術(shù)在國外還處在不斷提高和改進(jìn)的階段，在國內(nèi)此一技術(shù)還剛起步。焦仁杰等（1992)報告了以生物素標(biāo)記腺病毒的基因組探針與整裝抽提的細(xì)胞進(jìn)行電鏡原位雜交技術(shù)，成功地證明了腺病毒DNA與核骨架的緊密結(jié)合關(guān)系，膠體金顆粒呈簇狀與串珠狀結(jié)合在核骨架上。向正華等（1994)應(yīng)用地高辛標(biāo)記探針結(jié)合HRP的包埋前染色法顯示了POMc mRNA定位于神經(jīng)元的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。下面列舉幾種代表性的電鏡原位雜交技術(shù)。
一、應(yīng)用同位素標(biāo)記cRNA探針電鏡原位雜交技術(shù)于染色體制片（Hutchison et al, 1982)
（1)將整封染色體鋪片放置于金網(wǎng)上，在70%的酒精蒸汽固定4～15h，空氣干燥。
�。�2)以強(qiáng)堿使DNA變性，將金網(wǎng)置于2×SSC內(nèi)（應(yīng)用0.1n NaOH調(diào)整至pH12)，室溫，2min。
�。�3)脫水，以70%和95%酒精各沖洗3次，空氣干燥。
�。�4)雜交，金網(wǎng)覆于平面玻璃皿（ Petri dish)內(nèi)的雜交液滴上，每滴約10～15μl，將此小碟置于盛于雜交緩沖的大塑料盒內(nèi)，保持濕潤，在60～65℃孵育4～24h。
雜交液的配制：6×SSC或6×TNS（1×TNs =0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000～50000cpm/10μl 3h cRNA)。
�。�5)雜交后沖洗，金網(wǎng)自雜交液中取出后立即用大量的2×SSC沖洗多次。RNA酶溶液（20μg/ml)室溫沖洗，然后再用2×SSC室溫沖洗，沖洗后梯度酒精脫水（70%，95%)空氣干燥。
�。�6)浸入乳膠膜，應(yīng)用L-4核乳膠液，水稀釋4倍。浸膜后的金網(wǎng)，用膠帶固定在載玻片上放在密封的黑色塑料盒內(nèi)，4℃，時間根據(jù)同位素種類和靶mRNA含量而定，也可選擇不同時間曝光，根據(jù)顯影強(qiáng)弱確定最終顯影的時間。
（7)顯影。暗盒自冷房或冰箱中取出后，在室漸中回暖至少30min，以防核乳膠膜皺縮。然后在顯影液（Kodax Microdol X)顯影3～5min，溫度18～24℃。水沖，在15% Kodax快速定影液定影5min，然后在空氣中干燥。
所有溶液應(yīng)盡可能新鮮配制。
�。�8)電鏡觀察。
二、應(yīng)用生物素標(biāo)記DNA探針電鏡原位雜交技術(shù)
（一)基本原理
應(yīng)用DNA探針缺口翻譯（nick translation)方法，通過堿基配對以一條DNA鏈為模板，將生物素標(biāo)記的某一種脫氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP滲入有缺口的DNA鏈。將生物素標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交。顯示方法有二種：一種是用HRP顯示，類似免疫電鏡技術(shù)中采取的包埋前染色法，利用地高辛-過氧化物酶HRP顯色法進(jìn)行光鏡水平的厚片原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)染色，其步驟與第二十章 敘述的原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)基本方法相同，只是為了減少細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的損傷，在包埋過程中減少H2O2和Triton X-10等易損傷細(xì)胞與組織結(jié)構(gòu)的試劑用量（向正華等1993)。在顯色完畢后，取反應(yīng)陽性部位按常規(guī)電鏡操作程序進(jìn)行鋨酸后固定，脫水，包埋，切片和觀察。此法利用HRP免疫反應(yīng)產(chǎn)物具有極高電子反應(yīng)密度體積大小不一，加之非特異性反應(yīng)產(chǎn)物常掩蓋微細(xì)結(jié)構(gòu)的背景，不易達(dá)到準(zhǔn)確的定位。現(xiàn)在比較廣泛應(yīng)用的是生物素-蛋白A（PA)膠體金（gold)標(biāo)記技術(shù)。用于原位雜交的電鏡定位，取得較為滿意的效果。其基本原理是利用生物素標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交后，利用抗生物素抗體-結(jié)合蛋白A-金標(biāo)記雜交體的超微結(jié)構(gòu)定位，類似免疫電鏡中的包埋后染色。在包埋劑應(yīng)用方面，有報告應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋獲得成功的。但大多數(shù)較滿意的結(jié)果均獲自低溫親水性包埋劑——Lowicryl-K4M，也有應(yīng)用LR-white作為包埋劑的（詳見第七章 )。
