第七章 血液系統(tǒng)
第一節(jié) 血液凝固與抗凝
[實驗目的]
（1)學習用玻片法測定凝血時間。
（2)觀察家兔體外血凝、組織因子促凝和肝素抗凝過程，并分析各個過程度產(chǎn)生機制。
[實驗動物]
家兔，體重2.0～2.5kg/只，雌雄不拘。
[藥品、器材]
1． 藥品
蒸餾水、生理鹽水、3%戊巴比妥鈉溶液（或25%氨基甲酸乙酯)、1250單位/ml的低分子量肝素鈉溶液（臨用時配制)、肺組織浸液（含組織因子)。
肺組織浸液制備方法：取新鮮兔肺，剪成小塊，洗凈血液。磨成糊狀。加入3～4倍的生理鹽水，搖勻放冰箱中過夜，大濾紙過濾后，即可得肺組織浸液，保存冰箱備用。
2．器材
兔常用手術(shù)器械一套、兔臺、兔繩、玻璃分針、動脈小尼龍插管、動脈夾、縫合線、紗布；注射器：5ml注射器和7號針頭各4個
干凈、干燥的玻片：3塊標記筆1支干凈、干燥的大頭針3根多功能秒表1個水浴恒溫箱1個干凈、干燥的取血小試管1個
[觀察指標]
凝血時間測定（小時： 分鐘： 秒： )
[方法、步驟]
1．實驗前的準備
（1)打開水浴恒溫箱，灌入適量的自來水至試管架的平面，恒溫37 ℃。待用。
（2)取干凈、干燥的玻片3塊，編號，然后將玻片放入水浴恒溫箱的試管架上，加溫至37 執(zhí)業(yè)醫(yī)師℃，注意不要弄濕；
（3)動物準備
兔稱重后，用3%戊巴比妥鈉溶液1ml/kg體重（或25%氨基甲酸乙酯4ml/kg體重)麻醉，注射速度要慢；背位固定，行頸總動脈分離術(shù)和尼龍管插管術(shù)（暫不放血)。
（4)按表1中實驗的項目在玻片上分別用不同的5ml注射（安裝7號針頭)加入相應(yīng)的試劑。注意不要混淆。
表7-1家兔的體外血凝、抗凝和促凝因素對凝血時間的影響
| 凝血時間（小時： 分鐘： 秒： ) |
| 1號玻片上加入肺組織浸液1滴： 2號玻片上加入生理鹽水1滴： 3號玻片上加入肝素溶液1滴： |
2．凝血時間測定和記錄時間
（1) 取干凈、干燥的小試管1個，迅速放入動脈血2ml（注意：經(jīng)小尼龍管放血時，第一滴已激活的血液棄掉)；
（2)取血后，立即用5ml注射器（安裝7號針頭)抽取血液少許，并在每塊玻片的試劑上加入等量的1滴血液，在分別用大頭針混勻（注意不要混淆)的同時立刻計時（注意首先記錄1號玻片的凝血時間)。
（3) 每隔10秒，用大頭針在各玻片的血液中，朝一個方向挑血絲，見到第一個血絲的出現(xiàn)，立即終止計時。從開始計時到終止計時的一段時間即為玻片法的凝血時間。請將該時間記錄到表1中。
[注意事項]
（1)所用玻璃器皿要求干凈、干燥。
（2)專用試劑、大頭針和注射器不要混淆。
（3)計時要耐心、細心、和準確、因為第一凝血絲的出現(xiàn)是瞬間的。
（4)可利用第一節(jié)家兔的體外血凝、促凝和抗凝實驗的兔、試劑注射器，繼續(xù)做第二節(jié)家兔體內(nèi)的微循環(huán)、促凝和抗凝實驗)
[思考題]
（1)比較表1中各凝血時間，為什么時間有長短？
（2)在肺組織浸液促進血凝塊出現(xiàn)后立即加入肝素溶液1滴，仔細觀察兔凝血塊是否能溶解？為什么？
第二節(jié) 急性彌散性血管內(nèi)凝血
[實驗目的]
（1)觀察家兔體內(nèi)腸系膜微循環(huán)的血液流動特點。
（2)觀察組織因子在家兔體內(nèi)促凝過程和肝素預防組織因子在家兔體內(nèi)促凝過程，并分析各個的作用機制。
[實驗動物]
家兔，體重2.0～2.5kg/只，雌雄不拘。
[藥品、器材]
1．藥品
蒸餾水、生理鹽水、3%戊巴比妥鈉溶液（或25%氨基甲酸乙酯)、低分子量肝素鈉溶液（臨用時，一支肝素溶液用生理鹽水稀釋10倍)、肺組織浸液。
2．器材
Compact-X型全自動血液凝集分析儀；BL--2000型微循環(huán)觀察儀；手術(shù)器械一套、兔臺、兔繩、玻璃分針、動脈小尼龍插管、動脈夾、縫合線、紗布，5ml注射器3個、1ml注射器1個，計時鐘。
[觀察指標]
（1)腸系膜微循環(huán)凝血時間測定（小時： 分鐘： 秒： )，計時從注射試劑開始到血流停止為止。凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、 凝血酶時間(TT)/ 爬蟲酶時間、 纖維蛋白原(FIB)、凝血因子濃度(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)、抗Ⅹa因子肝素檢測、D二聚體。
（2)呼吸頻率（次/分)
（3)嘴唇、黏膜的發(fā)紺情況
[方法、步驟]
1．家兔腸招生簡章系膜微循環(huán)暴露手術(shù)
在兔右腹側(cè)部（近兔臺處)作一平行于兔身體縱軸的約2cm長的切口，打開腹腔，輕輕拿出一小段小腸，找出腸系膜的透明部分，將其置于低倍顯微鏡下，找到微循環(huán)血液流速很快的部分，并在高倍鏡下進一步找到含有數(shù)根僅有單個細胞通過的毛細血管的腸系膜，固定該視野，以便觀察其變化。（用濕潤的生理鹽水紗布輕輕蓋在腸系膜上)
2．續(xù)用第一節(jié)實驗的兔三只，分別編號1、2、3。做以下實驗：
（1) 注射生理鹽水組：在2min內(nèi)給1號兔緩慢靜脈注射生理鹽水4 ml；
（2) 肺組織浸液促凝組：在2min內(nèi)給2號兔緩慢靜脈注射生理鹽水2 ml和肺組織浸液2ml；
（3) 肝素溶液抗凝組： 在2min內(nèi)給3號兔緩慢靜脈注射肝素溶液2mlml肺組織浸液2ml。
表7-2家兔的體內(nèi)血凝、促凝和抗凝因素對凝血時間、呼吸及發(fā)紺的影響的結(jié)果記錄
| 凝血時間（小時： 分鐘： 秒： ) | 呼吸（次/分)、發(fā)紺
|
| 生理鹽水組 肺組織浸液促凝組 肝素溶液抗凝組 |
[注意事項]
（1)手術(shù)中要注意及時止血。
（2)微循環(huán)觀察部分不能移動、不能人為損傷和出血。
[思考題]
（1)比較三組的微循環(huán)情況，是否都有凝血？為什么？
（2)在肺組織浸液促凝組凝血后立即緩慢注射注射肝素溶液2ml，仔細觀察兔腸系膜微循環(huán)凝血情況是否能改善？為什么？
（3)在肺組織浸液促凝組凝血后若兔繼續(xù)存活，仔細觀察1～3小時后兔腸系膜微循環(huán)是否發(fā)生多處毛細血管壁破裂、出血現(xiàn)象即彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC)現(xiàn)象。DIC 怎樣預防？
第三節(jié) 血藥濃度半衰期測定
［實驗目的］
（1)掌握t1/2比色測定法。（2)了解藥物血漿A（t1/2)、生物利用度和表觀分布容積等概念。
（3)學會繪制藥物時—量曲線。
[實驗動物］
家兔，性別不拘。
［藥品、器材］
723型分光光度計、離心機、手術(shù)器械一套、注射器、2號注射針頭、動脈插管、動脈夾、微量定量移液管、試管架、大號試管、吸管、洗耳球。
3％戊巴比妥鈉、125單位/ml 肝素生理鹽水、20％磺胺嘧啶鈉（SD)、6％三氯醋酸、0．5％亞硝酸鈉、0．5％麝香草酚氫氧化鈉溶液。
［觀察指標］
吸光度值。
［方法、步驟］
1．標準曲線的制備。
（1)SD標準液配制，按下列步驟：
a．取20％SD溶液2．56毫升置于200毫升容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此濃度即128mg／100m1。
b．取上清液7．5m1用蒸餾水稀釋至10m1。這時SD的濃度96mg／100m1。
c．取濃度為128mg／100m1SD溶液100ml倍稀釋分別獲得64mg／100m1、32mg／100m1、16mg／l00m1、8mg／100m1SD溶液。
（2)取試管7支，編號。每支試管內(nèi)加6％三氯醋酸7．8ml，再分別加入不同濃度的SD標準液０．2m1(6支內(nèi))，另1支加入0．2mI蒸餾水。貼上標簽、混勻。
（3)再取試管7支，編號。按表7—1依次加入各種溶液后充分搖勻。
（4)用721型分光光度計比色，選擇520nm波長，讀出各試管光密度。
（5)以SD深度為橫坐標，光密度為縱坐標作標準曲線。
2．血標本制備：取家兔一只，稱重，用3％戊巴比妥鈉1ml／kg耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后固定，施頸部切開術(shù)，頸總動脈插管以備放血時用。耳緣靜脈注射0．5％肝素1m1／kg，5分鐘后放血0.5m1，同時注入20％SD溶液2m1／kg。分別于給藥后的第0、5、10、20、30、40、60分鐘時放血0.5m1。
取離心管8支，加入6％三氯醋酸7．8m1，然后從0．5m1各血樣本中準確吸取0.2ml于離心管，混勻，離心(1500轉(zhuǎn)，5分鐘)，分別取上清液于另外8支試管中，待用。
2． 比色測定
3． 按表7—2進行。
表7-3 標準曲線的制備
| 7 空白 | 6 （8mg/ 100ml) | 5 (16mg/ 100ml) | 4 (32mg/ 100ml) | 3 (64mg/ 100ml) | 2 (90mg/ 100ml) | 1 (128mg/ 100ml) | |
| ②步中標準液（ml) ②步中蒸餾水（ml) 0.5%亞硝酸鈉（ml) 0.5%麝香草酚（ml) | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 |
表7-4
| 空白管 | 待測管 | |
| 給藥前上清液(m1) 給藥后上清液(m1) 0.5％亞硝酸納(m1) 0.5％麝香草酚(m1) | 3 1 2 | 3 1 2 |
用723型分光光度計進行比色，選擇520nm波長，讀出吸光度(A)值。將結(jié)果填入表6-3
表7-5給藥后不同時間兔血SD濃度
| 0′ | 5′ | 10′ | 20′ | 30′ | 40′ | 60′ | |
| 光密度(A) 濃 度(C) 濃度對數(shù)(lgC) |
要求： 1．以時間為橫坐標，血藥濃度的對數(shù)為縱坐標，繪制t—lgc曲線。
2．從t—lgc曲線上取兩點，按下式計算出SD的血漿濃度半衰期：
t1/2= 0.301
(lgC1—lgＣ2)/Δt
3．按下式計算表觀分布容積：
Vd = A(mg)
Co(mg／ml)
4．按下式計算生物利用度：
F＝ 吸入體循環(huán)藥量
給藥總量×100%
［注意事項］
1．給SD時一定要注入靜脈內(nèi)，若注射至皮下將會影響t1／2測定。
2．每次取血前先將插管中殘血放掉。
3．每吸取一個血樣時，必須更換吸嘴。
4．操作程序不得顛倒，每次加試劑后必須混勻。
5．采血時間不準時，應(yīng)記錄實際時間。
6．血液加到裝三氯醋酸試管內(nèi)立即振搖，否則易出現(xiàn)凝血塊。
［思考題］
1．試述t1／2、Vd、F的定義和意義。
2．某藥的最低有效血濃度為2．0mg/100m1，t1／2為10.7小時。測得患者血藥濃度4.7mg/100m1，試問尚能保持有效濃度幾小時?(計算公式Ct＝Co×0.5t/t1 / 2)
（謝志忠 廖端芳)
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凝血前 凝血后